作者使用彈性系數大約0.09N/m、曲率半徑大約8nm的AC40探針測試細胞樣品的模量和硬度，利用BioAFM的SPM軟件進行Sader法校準（Contact-free）探針。在使用QI模式進行掃描時，作用力被設定為不損壞細胞的情況下的最大值。對于固定細胞作用力大約3 nN，活細胞大約1 nN。通過明場顯微鏡觀察細胞的形態和QI模式中力曲線是否發生破裂（rupture event）即可判斷細胞是否受損。得益于NanoWizard UltraSpeed原子力顯微鏡的高速性能，探針在Z方向的速度（Z speed）達到了300 μm/s，Z方向距離（Z range）為2 μm，力曲線的噪聲控制在19-24 pN。

(a) 細胞表面形貌圖（作用力為零，平面擬合）。(b) 細胞表面受作用力后的形貌圖（3 nN，平面擬合）。(c) 在每個點擬合FD力曲線計算的表觀彈性模量圖。(d) 不同壓入深度下的剛度斷層圖：左側： [0–50] nm，右側： [200–250] nm。(e) 對應于不同細胞內區域的表觀彈性模量。(f) 結合STED超分辨率顯微鏡識別細胞區域。左：DAPI，中：LC3，右：肌動蛋白。(g) 結合透射電子顯微鏡獲得的超微結構（2張切片）。白色箭頭：肌動蛋白；紅色虛線：細菌；白色環：線粒體。比例尺：白色：2 μm，黑色：500 nm。

為了測試細胞內微生物的模量，作者對感染了假結核病桿菌（Yersinia pseudotuberculosis）的固定PtK2細胞進行了原子力顯微鏡（AFM）實驗。細胞被感染后固定，并標記了肌動蛋白細胞骨架、細菌和LC3陽性的自噬泡。通過明場顯微鏡、熒光顯微鏡、AFM以及電子顯微鏡依次對單個細胞進行成像（圖2a、f和g）。圖2a顯示了細胞在探針作用力為零時的圖像。此時細胞內部區域不可見，但我們可以觀察到固定對膜孔的影響。圖2b顯示了在最大壓入深度時細胞的高度圖。樣品內的不同硬度導致了相同施加力的不同最大壓入深度。一些結構（可能對應于細菌、線粒體和肌動蛋白細胞骨架）變得清晰可見。經熒光和電子顯微鏡可以確認細菌（紅色虛線）的位置（圖2f和g）。細菌用DAPI和LC3標記，表明細菌位于自噬泡中（圖2f左和中）。AFM和熒光觀察還可以獲得有關肌動蛋白細胞骨架的相關性。最后，線粒體通過電子顯微鏡觀察到（圖2g）。通過表觀彈性模量圖（圖2c）可以看出來肌動蛋白池和細菌的似乎比線粒體更硬。通過對不同感興趣區域的彈性模量進行量化可以證實這一點（圖2e）。對同一數據上在兩個壓入深度[0–50] nm和[200–250] nm上執行了剛度斷層掃描（圖2d）后，可以發現在低壓入深度時，可以識別出3個肌動蛋白束。在更大的壓入深度時，這些束消失了。這表明它們位于細胞頂部，而AFM在細胞更深處探測到了幾個線粒體。

 (a) CCCP處理前后活體PtK2細胞內線粒體的熒光圖像，0分鐘（頂部）和30分鐘（底部）（比例尺5 μm）；(b) 1 nN下的AFM測得形貌；(c) 實驗中的樣品下壓FD力曲線。頂部：均勻彈性材料；中部和底部：由于遇到硬細胞器而產生的兩個不連續的示例；(d) CCCP處理細胞在[50–100] nm壓入深度處的剛度圖（比例尺2 μm）（左）隨時間變化的線粒體區域（白色虛線）的對應剛度值（右）；(e) 對照組活體PtK2細胞內線粒體的熒光圖像（比例尺5 μm）（左），對照組細胞在[60–120] nm壓入深度處的剛度圖（比例尺2 μm）（中），隨時間變化線粒體區域（白色虛線）的對應剛度值（右）。

接下來作者使用抑制藥物碳酰氯化苯基腙（CCCP）來干擾線粒體生理學，該藥物可以解偶線粒體氧化磷酸化并主要作為質子載體，降低ATP合酶的功能。同時使用光學顯微鏡和原子力顯微鏡（圖4a和b）能夠實時跟蹤藥物對線粒體伸長結構的破壞作用，最終導致線粒體碎裂。實驗開始時，大多數線粒體呈纖維狀。在暴露于藥物5分鐘后，已經能夠檢測到線粒體管狀網絡的紊亂（圖4a和b）。通過力曲線（圖4c）可以觀察到細胞內結構硬度的增加（圖4d）。結合光學顯微鏡，能夠確認這些結構與線粒體碎片有關。在對照組中，未經處理的細胞中沒有測量到這種劇烈的硬度變化（圖4e）。

原文鏈接：Nanoscale, 2019,11, 10320-10328, https://doi.org/10.1039/C8NR08955H  

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