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MicroRNAs (miRNAs)在控制各種細胞的生理過程中發揮著關鍵作用。在癌癥等病理條件下，個體miRNA的表達水平可能會發生顯著變化。如果能在單細胞水平上準確、定量的檢測miRNA將有助于更好的理解miRNA的功能。雖然Northern印跡、PCR、納米孔傳感器和單分子熒光顯微鏡等方法都可以定量分析miRNA。但是由于濃度、靈敏度、可重復性等問題，這些方法仍有其局限性。韓國浦項科技大學的Joo Won Park等人報道了一種使用原子力顯微鏡直接檢測miRNA的方法。（J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 36, 11664–11671）1通過掃描微米大小的DNA斑點，原子力顯微鏡可以量化單個神經元中的miR-134 RNA數量；可以在去膜后的固定神經元細胞上觀察到單個miR-134 RNA分子。

圖1上半部分：為了定量化檢測特定miRNA，從單個細胞中提取總RNA，并使目標miRNA與探針DNA點雜交；下半部分：在固定的單個細胞上繪制特定miRNA的原位分布，并使探針DNA與固定的miRNA雜交。利用連接HBD的原子力顯微鏡探針產生的力-距離力曲線中的特定粘附力來識別miRNA/DNA雜交物。單個的miRNA/DNA雜交物在粘附力圖上呈現為一簇像素。

作者將N末端的人RNase H1蛋白通過表面修飾的方法固定在原子力顯微鏡針尖上。這種蛋白可以結合RNA/DNA雜交雙鏈，稱為雜交結合域（hybrid binding domain, HBD），在這里作者使用結構更穩定的DNA探針而不是RNA來檢測mRNA。在實驗中，修飾后的探針用于檢測一種腦特異性miRNA，miR-134。這是一種能夠調節脊椎生長和樹突生成的腦特異性miRNA。

為了驗證特異性的識別，作者首先將全部RNA從細胞中提取出來，并將其與固定在玻璃片上面積大約15-20平方微米的探針DNA斑點雜交。使用布魯克ForceRobot原子力顯微鏡2進行單分子力曲線測試，實驗結果發現粘附力大約在20pN上下，解離距離大約3.8nm。通過對比修飾后探針與單鏈ssDNA，雙鏈dsDNA和雙鏈dsRNA斑點以及經過RNase H處理后的斑點間的力曲線，可以確認這是一種特異性結合。在實驗中，可以發現當AFM掃描像素點尺寸在4nm時，miR134的粘附力圖為一個由34個像素點組成的團簇，并且在大多數像素點上觀察到特異性結合的概率不低于40%。這一團簇可以被擬合為一個橢圓，等效圓半徑14nm。這一尺寸與結合構型中的分子尺寸一致。通過是否產生粘附力團簇、特異性結合產生的概率即可判斷原子力顯微鏡探針是否檢測到了目標mRNA分子。

圖2 對miR-134進行選擇性識別。miR-134和pre-miR-134分別與單個的探針DNA點雜交。在識別miR-134的探針DNA斑點時，觀察到了在粘附力圖像中的聚集現象。相比之下，在識別pre-miR-134的探針DNA斑點上沒有觀察到聚集的粘附力。在粘附力力圖中，每個像素上觀察到特異性結合概率以灰度顯示（30 × 30像素，240 × 240 nm2）。

根據估計，單個miRNA種類在細胞中的平均拷貝數約為500。為了確保能在單個細胞中識別目標miRNA，作者使用FluidFM探針3制備了直徑為3-8 μ m的探針DNA斑點，通過將合成miR-134溶液（10-100 aM，40 μL中含有240-2400個拷貝）孵育在其中一個斑點上來評估識別效率。作者在每一個樣品的每一個斑點中的三個任意位置記錄粘附力數據并取平均值，計算了每個斑點上識別到的miR-134數目。通過線性回歸，作者計算出DNA斑點上miR-134的識別效率為78%。

圖3 DNA斑點上的miR-134。（a）在方格圖案化的玻璃片上生成的探針DNA（在3'端修飾Cy3）斑點的共聚焦顯微鏡圖像。比例尺，10 μm。（b）在單獨的DNA斑點上檢測10-100 aM（240-2400個拷貝）的miR-134（30 × 30像素，300 × 300 nm^2）。觀察到特異性miR-134力曲線數量與樣品溶液中miR-134的初始數量之間呈線性相關，并且從線性回歸的斜率計算出捕獲效率為78%。（一個實心圓表示兩個數據點重疊。）

在驗證了這一方法可以成功識別體外RNA后，作者進一步將這一方法應用于單個海馬體神經細胞上。使用進行修飾后可以與miR-134互補的原子力顯微鏡探針，作者在神經元體的隨機位置進行了力曲線測試。作者使用布魯克NanoWizard原子力顯微鏡4對MAP2免疫染色標記的神經元在AC模式下進行成像，并選擇了三個位置進行粘附力測試（100×100像素，1.0×1.0 μm2），在同一位置得到細胞熒光圖像、原子力顯微鏡圖像與力曲線數據（圖4）。在神經元體上，每個圖像中可以觀察到2-4個團簇。RNase H處理后同一區域中團簇的消失，這同樣證實了觀察到的粘附力曲線是具有特異性的。在固定的神經元上，只有當探針DNA與目標RNA雜交時才觀察到合格的簇，而當互補RNA或亂序DNA雜交時則不會觀察到團簇，這與在玻璃片上DNA探針斑點上獲得的結果一致，即這一miRNA/DNA雜交是特異性檢測。

圖4 在固定的神經元上繪制miR-134分布。（a）海馬神經元（DIV7），MAP2；綠色。（b）a中的方框區域進行原子力顯微鏡成像。（c）b中編號的區域在與miR-134互補DNA雜交后進行粘附力實驗。（d）相同的區域在用相同的探針進行RNase H處理后重新測試，未觀察到團簇。（c, d）黃色像素表示在五次測量中觀察到特定粘附力超過一次的位置（100 × 100像素，1.0 × 1.0 μm2）。a中的比例尺為50 μm，b中的比例尺為20 μm。

為了進一步驗證這種方法的準確性與特異性，作者還分析了在固定的神經元上膜去極化誘導的miR-134表達變化。在固定前，海馬神經元（DIV7）通過KCl（40 mM）處理2小時以誘導去極化。在受刺激的神經元（1.0×1.0 μm2）的區域內平均觀察到了9.9個團簇，而在未受刺激的對照神經元中僅檢測到了2.7個簇（見圖5）。使用共聚焦顯微鏡觀察c-Fos的表達增加，進一步驗證了KCl刺激神經元的效果。雖然需要進一步研究了解AFM探針的壓入深度和樣品制備的影響，但這種直接的AFM粘附力圖像觀察到的簇數增加與在DNA探針斑點上通過提取出RNA進行宏觀評估的結果一致。同一細胞上不同位置和同一條見下不同細胞間miR-134數量變化很小，證明了其在DIV7海馬體神經元內是全局性表達的。

作者通過建立了一種基于原子力顯微鏡的粘附力成像新型miRNA定量方法。這種方法的靈敏度足以在單個細胞中分析特定miRNA的拷貝數，而無需修飾、逆轉錄或擴增。同時可以實現單個miRNA的原位測試。結合AFM的高分辨率特性，這種方法同樣適用于神經元的其他區域，如樹突和突觸。如果借助快速原子力顯微鏡，將能夠高效地可視化單個細胞的整個表面。此外，使用固定細胞和組織的切片能夠檢查細胞的內部和特定的細胞亞結構。這種新的分析方法為理解miRNA的生物學作用及其細胞間變異提供了新的途徑。在生物樣品中檢測少量的miRNA生物標志物將使得這種方法能夠作為一種可行的癌癥診斷工具。

圖5 神經元細胞通過膜去極化誘導增強表達miR-134。（a）未受刺激的海馬體DIV7細胞與在固定前經過40 mM KCl 2小時刺激的細胞。二者均經過MAP2免疫染色。（b）原子力顯微鏡圖像。a比例尺50 μm，b比例尺20 μm。（c）在神經元體上隨機位置測試得到的粘附力圖像。測試位置在b中用藍色箭頭標注。（100 × 100像素，1.0 × 1.0 μm2）特異性粘附力產生概率超過20%的區域用黃色標注，團簇用紅色圓圈標注。（d）在三個神經細胞上分別進行了三個不同位置的miR-134團簇檢測。

1.Visualization and Quanti?cation of MicroRNA in a Single Cell Using Atomic Force Microscopy

 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27529574) 

在這篇文章中，作者使用了三種布魯克生物型原子力顯微鏡或附件：

2.布魯克ForceRobot? 400生物型AFM結合了許多獨特的力譜創新技術以在單分子水平上測量力。它能夠量化單個分子鍵的機械強度，并對分子相互作用和生物分子復合物的力依賴特性進行表征。

（https://www.bruker.com/zh/products-and-solutions/microscopes/bioafm/jpk-forcerobot.html）

3.FluidFM中空探針配件可以輕易的與布魯克生物型原子力顯微鏡結合，可以輕松的處理微量液體。

（https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/bioafm/bioafm-accessories/fluidfm-add-on-from-cytosurge.html）

4.NanoWizard? 4 XP生物型原子力顯微鏡可置于倒置光學顯微鏡上，對從單分子到活細胞和組織的樣品進行長期實驗，具有優異的機械和熱穩定性。

（https://www.bruker.com/zh/products-and-solutions/microscopes/bioafm/jpk-nanowizard-4-xp-bioscience.html）