細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)是一項(xiàng)關(guān)鍵的QC放行檢測(cè)，這意味著生物制品只有通過(guò)該項(xiàng)測(cè)試才能向公眾放行使用。過(guò)去30年來(lái)，內(nèi)毒素檢測(cè)一直使用從鱟中提取的鱟試劑，檢測(cè)藥品和疫苗。在這段時(shí)間里，內(nèi)毒素檢測(cè)和技術(shù)幾乎沒有變化，直到最近才有了極小的改進(jìn)。業(yè)界已經(jīng)看到了傳統(tǒng)內(nèi)毒素檢測(cè)的弊端，并表達(dá)了很多理由，為什么改進(jìn)內(nèi)毒素檢測(cè)會(huì)非常有用。業(yè)內(nèi)通過(guò)采用創(chuàng)新技術(shù)來(lái)尋求改進(jìn)內(nèi)毒素檢測(cè)，這些創(chuàng)新不僅可以減少檢測(cè)時(shí)間，還可以提高數(shù)據(jù)可靠性，以便更有效、更安全地將產(chǎn)品提供給患者。

使用傳統(tǒng)的凝膠法和96孔板方法有一些注意事項(xiàng)。這些陳舊的技術(shù)都是手動(dòng)的，需要分析員在QC實(shí)驗(yàn)室里花大量時(shí)間操作。需要的人工干預(yù)越多，內(nèi)毒素檢測(cè)就越容易出現(xiàn)錯(cuò)誤。凝膠法是一種定性測(cè)試，也就是一種合格或不合格的測(cè)試。96孔板動(dòng)力學(xué)方法是凝膠法的升級(jí)版，因?yàn)檫@些測(cè)試是定量的、半自動(dòng)化的。但這些方法仍需要大量時(shí)間來(lái)設(shè)置和執(zhí)行，并容易出現(xiàn)一系列的錯(cuò)誤。

內(nèi)毒素檢測(cè)

是一項(xiàng)非常敏感的測(cè)試，可檢測(cè)到低至萬(wàn)億分之一的內(nèi)毒素（相當(dāng)于奧林匹克標(biāo)準(zhǔn)泳池中的一粒沙子）。這種檢測(cè)手段靈敏度非常高，但也意味著用戶造成的任何類型的小污染都很可能會(huì)被檢測(cè)到。藥企希望更快地將他們的產(chǎn)品推向市場(chǎng)以幫助患者，因此如果由于污染導(dǎo)致內(nèi)毒素檢測(cè)失敗或無(wú)效，這將需要重新檢測(cè)、調(diào)查原因，并最 終延遲向有需要的患者放行此產(chǎn)品的時(shí)間。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)是一項(xiàng)關(guān)鍵的QC放行檢測(cè)，這意味著生物制品只有通過(guò)該項(xiàng)測(cè)試才能向公眾放行使用。過(guò)去30年來(lái)，內(nèi)毒素檢測(cè)一直使用從鱟中提取的鱟試劑，檢測(cè)藥品和疫苗。在這段時(shí)間里，內(nèi)毒素檢測(cè)和技術(shù)幾乎沒有變化，直到最近才有了極小的改進(jìn)。業(yè)界已經(jīng)看到了傳統(tǒng)內(nèi)毒素檢測(cè)的弊端，并表達(dá)了很多理由，為什么改進(jìn)內(nèi)毒素檢測(cè)會(huì)非常有用。業(yè)內(nèi)通過(guò)采用創(chuàng)新技術(shù)來(lái)尋求改進(jìn)內(nèi)毒素檢測(cè)，這些創(chuàng)新不僅可以減少檢測(cè)時(shí)間，還可以提高數(shù)據(jù)可靠性，以便更有效、更安全地將產(chǎn)品提供給患者。

使用傳統(tǒng)的凝膠法和96孔板方法有一些注意事項(xiàng)。這些陳舊的技術(shù)都是手動(dòng)的，需要分析員在QC實(shí)驗(yàn)室里花大量時(shí)間操作。需要的人工干預(yù)越多，內(nèi)毒素檢測(cè)就越容易出現(xiàn)錯(cuò)誤。凝膠法是一種定性測(cè)試，也就是一種合格或不合格的測(cè)試。96孔板動(dòng)力學(xué)方法是凝膠法的升級(jí)版，因?yàn)檫@些測(cè)試是定量的、半自動(dòng)化的。但這些方法仍需要大量時(shí)間來(lái)設(shè)置和執(zhí)行，并容易出現(xiàn)一系列的錯(cuò)誤。

內(nèi)毒素檢測(cè)

是一項(xiàng)非常敏感的測(cè)試，可檢測(cè)到低至萬(wàn)億分之一的內(nèi)毒素（相當(dāng)于奧林匹克標(biāo)準(zhǔn)泳池中的一粒沙子）。這種檢測(cè)手段靈敏度非常高，但也意味著用戶造成的任何類型的小污染都很可能會(huì)被檢測(cè)到。藥企希望更快地將他們的產(chǎn)品推向市場(chǎng)以幫助患者，因此如果由于污染導(dǎo)致內(nèi)毒素檢測(cè)失敗或無(wú)效，這將需要重新檢測(cè)、調(diào)查原因，并最終延遲向有需要的患者放行此產(chǎn)品的時(shí)間。

關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，最常見的應(yīng)用是通過(guò)RT-qPCR進(jìn)行基因表達(dá)分析、疾病診斷和管理（如病毒定量）、食品檢測(cè)（如轉(zhuǎn)基因或過(guò)敏原分析）以及動(dòng)物或植物育種等研究。這種方法非常靈敏，因此為了得到可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，避免錯(cuò)誤是十分重要的。RT和qPCR數(shù)據(jù)評(píng)估的整個(gè)工作流程包括以下幾點(diǎn)：

1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2、樣品的制備和提取/純化

3、RT和qPCR

4、數(shù)據(jù)評(píng)估

在以上過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員有可能因?yàn)椴僮麇e(cuò)誤或失誤導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的失真。但往往有些錯(cuò)誤的來(lái)源又十分不明確，所以排除故障的第一步是需要再次檢查實(shí)驗(yàn)流程并重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

RT或qPCR反應(yīng)的第一個(gè)重要步驟是測(cè)定PCR產(chǎn)物及驗(yàn)證相應(yīng)的引物和探針。實(shí)時(shí)RT-qPCR引物和探針最有效的設(shè)計(jì)是使用引物設(shè)計(jì)軟件，大多數(shù)軟件都可以調(diào)整設(shè)置參數(shù)的最佳屬性，以檢索到符合要求的引物探針序列。這些設(shè)置參數(shù)考慮熔化溫度Tm、互補(bǔ)性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及擴(kuò)增子大小和其他重要因素。同時(shí)建議跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物，避免來(lái)自gDNA的干擾，直接得到cDNA片段。對(duì)于基因特異性引物的設(shè)計(jì)，應(yīng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：

擴(kuò)增子大小: 75-200 bp

引物長(zhǎng)度: 18-30 bp

GC 含量: 40-60%

解鏈溫度: 55-60℃

3' 端: 1-2 G or C，以具有良好的穩(wěn)定性

不超過(guò)3個(gè)G or C （可能不匹配）

沒有二級(jí)結(jié)構(gòu)，重復(fù)序列或回文結(jié)構(gòu)

濃度: 150-200 nM

樣品的制備和提取/純化

模板的質(zhì)量直接影響到檢測(cè)性能，在qPCR結(jié)果的故障排除過(guò)程中也需要考慮。首先，組織取樣和保存是實(shí)驗(yàn)可變性的第一個(gè)潛在來(lái)源。對(duì)于基因的定量，必須使用高質(zhì)量的RNA，這意味著需要非常仔細(xì)地檢查RNA的濃度和質(zhì)量。

降解或不純的RNA會(huì)限制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率，降低產(chǎn)量；部分降解的RNA可能不能給出準(zhǔn)確的基因表達(dá)結(jié)果。核酸應(yīng)從新鮮或立即冷凍的組織中提取和純化；同時(shí)建議使用生物學(xué)重復(fù)（至少3個(gè)）。RNA或DNA的分離是PCR實(shí)驗(yàn)前的關(guān)鍵步驟。這是必要的，以便提取對(duì)所有樣本都是有效的，并得到純化的核酸（DNA，RNA）。可采用高分辨率瓊脂糖凝膠檢測(cè)核酸質(zhì)量和分光光度法（A260/A280=1.8和A260/A230=2.0）檢測(cè)核酸純度。

另外也要注意，用于PCR制備的工作空間所有臺(tái)面及物品都應(yīng)進(jìn)行常規(guī)去污，以防止交叉污染。

逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

RT-qPCR是一種分析DNA或RNA的高靈敏性工具。當(dāng)PCR擴(kuò)增靶標(biāo)時(shí)，錯(cuò)誤同時(shí)被放大。可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化和盡量減少移液步驟來(lái)減少PCR反應(yīng)中的技術(shù)錯(cuò)誤；在無(wú)灰塵的干凈環(huán)境中建立反應(yīng)；通過(guò)對(duì)無(wú)模板（水）對(duì)照進(jìn)行PCR反應(yīng)，常規(guī)檢查引物和試劑庫(kù)存的DNA污染等。

在進(jìn)行qPCR時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)以下故障：沒有擴(kuò)增、qPCR效率多大或過(guò)小、Cq值過(guò)大、重復(fù)性差、擴(kuò)增曲線異常、非特異性擴(kuò)增等等。

運(yùn)行后的數(shù)據(jù)分析-基線和閾值的設(shè)置

基線校正是去除背景熒光的必要條件。可能的原因是qPCR設(shè)備的檢測(cè)器噪音，或是不同的樣品量或染料（探針或插入染料）的殘留熒光。所有樣本的基線起點(diǎn)一般從0~3個(gè)循環(huán)開始進(jìn)行量化，基線終點(diǎn)是在各個(gè)擴(kuò)增曲線起峰位置前的1~2個(gè)循環(huán)。為了使實(shí)時(shí)RT-qPCR數(shù)據(jù)有意義，應(yīng)在擴(kuò)增曲線的指數(shù)擴(kuò)增階段設(shè)置閾值，閾值自動(dòng)設(shè)置一般是基線期熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)可為您提供3/6檢測(cè)通道，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活配置。這款產(chǎn)品采用高能LED作為光源系統(tǒng)，可保證光源強(qiáng)度高，光源一致性好；高品質(zhì)的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統(tǒng)，升降溫速率快，可設(shè)置12列跨度30°C的溫度梯度；CMOS拍照+光纖信號(hào)傳輸作為檢測(cè)系統(tǒng)，CMOS檢測(cè)靈敏度高，光纖傳輸速度快，無(wú)光損失和噪音干擾，無(wú)需ROX校準(zhǔn)。Cielo?實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)可為您的科學(xué)研究提供高精準(zhǔn)度、高靈敏度和高可靠性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

全聚焦方式（TFM）

隨著可進(jìn)行全聚焦方式（TFM）檢測(cè)的設(shè)備陸續(xù)進(jìn)入市場(chǎng)，無(wú)損檢測(cè)（NDT）行業(yè)也在經(jīng)歷著一個(gè)技術(shù)進(jìn)步突飛猛進(jìn)的重要時(shí)期。全聚焦方式（TFM）的出現(xiàn)標(biāo)志著相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）技術(shù)又向前邁出了重要的一步。然而，一些相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）的從業(yè)人員可能仍然對(duì)全聚焦方式（TFM）及其與全矩陣捕獲（FMC）的關(guān)系，以及傳統(tǒng)相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）和全聚焦方式/全矩陣捕獲（TFM/FMC）處理之間的差異，感到困惑。這則應(yīng)用注釋可使那些熟悉相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）成像的檢測(cè)人員對(duì)全聚焦方式（TFM）成像有個(gè)基本的了解。為了使說(shuō)明簡(jiǎn)潔清晰，本文對(duì)超聲傳播模式方面的知識(shí)不予說(shuō)明。

傳統(tǒng)相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）成像

超聲相控陣技術(shù)的標(biāo)志是在被測(cè)工件中所需關(guān)注的位置聚焦和偏轉(zhuǎn)聲束的能力。相控陣聚焦方法為相控陣探頭的發(fā)射晶片和接收晶片使用延遲，以使短脈沖波形的渡越時(shí)間在所需關(guān)注的位置處實(shí)現(xiàn)同步。在樣件的聚焦區(qū)域，所生成聲束的寬度變窄，且相應(yīng)的探測(cè)分辨率顯著提高。

物理聲束形成
傳統(tǒng)相控陣在發(fā)射聲束的過(guò)程中使基本聲波以物理方式疊加在一起，生成一個(gè)在被測(cè)樣件內(nèi)特定深度上聚焦的聲束。發(fā)射晶片組形成一個(gè)孔徑，從這個(gè)孔徑產(chǎn)生一個(gè)相干聲脈沖。傳統(tǒng)相控陣發(fā)射脈沖的行為被稱為“物理”聲束形成。例如，在S掃描中，物理聲束形成的采集過(guò)程會(huì)為用戶指定的每個(gè)角度進(jìn)行。

合成聲束形成
在發(fā)射器、散射體和接收器之間的聲學(xué)回路的末端，組成接收孔徑的晶片會(huì)將來(lái)自被測(cè)樣件的所有回波作為A掃描記錄下來(lái)。A掃描數(shù)據(jù)包含回波波幅和傳播時(shí)間。為了增強(qiáng)樣件中某個(gè)特定區(qū)域的接收靈敏度，A掃描被延遲并總和，好像聚焦是通過(guò)物理聲束形成而實(shí)現(xiàn)的。不過(guò)，這一次，所有的延遲和總和都發(fā)生在采集設(shè)備的軟件中。這種接收聲束形成被稱為“合成”聲束形成。合成聲束形成所需的所有計(jì)算都在專用的前端電子設(shè)備中進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)了快速、實(shí)時(shí)成像。

傳統(tǒng)相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）的局限性
相控陣聚焦的好處是明顯提高了聚焦區(qū)域的靈敏度，從而可在局部區(qū)域提高探測(cè)性能。不過(guò)，這種提高的靈敏度僅 限于被測(cè)工件中某個(gè)可控且固定的深度。位于聚焦區(qū)域之外的反射體會(huì)顯得模糊不清，而且會(huì)比位于聚焦區(qū)域內(nèi)的同等大小的反射體看起來(lái)更大些。

FMC（全矩陣捕獲）：一種采集策略

TFM（全聚焦方式）：圖像的重建

全聚焦方式（TFM）：高分辨率圖像的構(gòu)建

全聚焦方式（TFM）是相控陣基本聚焦原理在被測(cè)樣件的所限定關(guān)注區(qū)域（ROI）中的系統(tǒng)性應(yīng)用。關(guān)注區(qū)域（ROI）被分割成一個(gè)由位置或者“像素”組成的網(wǎng)格，而且網(wǎng)格中的每個(gè)像素會(huì)通過(guò)相控陣聲束形成的方法得到聚焦。到目前為止，全聚焦方式（TFM）是生成這種可在各個(gè)位置和深度上聚焦的關(guān)注區(qū)域圖像的最有效方法。

然而，如果將通過(guò)物理聲束形成采集而實(shí)現(xiàn)的相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）采集策略應(yīng)用于全聚焦方式，則生成單個(gè)全聚焦方式（TFM）圖像所用的時(shí)間會(huì)使人們對(duì)大多數(shù)無(wú)損檢測(cè)（NDT）應(yīng)用的部署望而卻步。例如，生成一個(gè)全聚焦方式（TFM）圖像所需的像素?cái)?shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生成一個(gè)可覆蓋相同關(guān)注區(qū)域的S掃描所需的不同角度的數(shù)量。通過(guò)物理聲束形成方式以100個(gè)不同角度進(jìn)行掃查而獲得的一個(gè)S掃描需要100次采集，而由100 × 100像素構(gòu)建的全聚焦方式（TFM）圖像則需要10000次物理聲束形成采集。

為了避免這個(gè)采集數(shù)量過(guò)多的問(wèn)題，可以采用另一種采集策略：通過(guò)為發(fā)射相位和接收相位應(yīng)用合成聲束形成的方法，計(jì)算網(wǎng)格中的波幅值。這種采集策略需要對(duì)應(yīng)于關(guān)注區(qū)域（ROI）網(wǎng)格的每個(gè)像素位置的一組聚焦法則，以及一組原始基礎(chǔ)波形，即基本A掃描。獲取這組基本A掃描的有效方法是全矩陣捕獲（FMC）數(shù)據(jù)采集。

FMC（全矩陣捕獲）：一種用于實(shí)現(xiàn)全聚焦方式（TFM）的采集策略
全矩陣捕獲（FMC）是一個(gè)采集過(guò)程，可以獲得所有成對(duì)的發(fā)射晶片和接收晶片生成的所有A掃描（波幅時(shí)間序列）。這些基本A掃描存儲(chǔ)在全矩陣捕獲（FMC）數(shù)據(jù)集中。為了獲得較好聚焦效果，應(yīng)該使用構(gòu)成探頭整個(gè)孔徑的所有晶片，通過(guò)合成聲束形成方式，生成全矩陣捕獲（FMC）數(shù)據(jù)集。在這種情況下，建立全矩陣捕獲（FMC）數(shù)據(jù)集所需的采集次數(shù)等同于探頭晶片的數(shù)量。全矩陣捕獲（FMC）數(shù)據(jù)集提供有關(guān)探頭每個(gè)晶片之間聲束傳播的所有信息，包括不同介質(zhì)交界處的反射以及由缺陷引起的散射等信息。任何類型的相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）圖像都可以通過(guò)使用適當(dāng)選擇的延遲基于全矩陣捕獲（FMC）數(shù)據(jù)集重建，其中包括：扇形掃描、平面波成像（PWI）、動(dòng)態(tài)深度聚焦（DDF）、全聚焦方式（TFM）等。

雖然通過(guò)全矩陣捕獲（FMC）采集過(guò)程生成圖像所需的采集數(shù)量與相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）可能大致相同，但是要處理單個(gè)全矩陣捕獲（FMC）數(shù)據(jù)集，卻需要很大的存儲(chǔ)容量、很寬的傳輸帶寬，以及很強(qiáng)的計(jì)算能力。取決于所用設(shè)備的電子器件，獲得全聚焦方式/全矩陣捕獲（TFM/FMC）結(jié)果的速度可能會(huì)比傳統(tǒng)相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）更慢。

以實(shí)驗(yàn)案例說(shuō)明相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）和全聚焦方式（TFM）圖像的差異
為了說(shuō)明相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）和全聚焦方式（TFM）成像之間的差別，我們?cè)诖私榻B一個(gè)使用線性相控陣（PA）探頭對(duì)鋼塊中垂直分布的幾個(gè)相同的橫通孔（SDH）進(jìn)行掃查的設(shè)置。

這里的相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）S掃描（圖a）和全聚焦方式（TFM）圖像（圖b）使用相同的檢測(cè)配置、OmniScan X3探傷儀、5L64-A2探頭、SA2-N55S-IHC楔塊，及32晶片孔徑獲得。

在相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）S掃描（圖a）中，每個(gè)A掃描都使用唯 一的22毫米聚焦深度獲得。處于聚焦區(qū)域內(nèi)的幾個(gè)橫通孔（SDH）以相似的波幅和大小出現(xiàn)在圖像中。位于聚焦深度以外較遠(yuǎn)的橫通孔的圖像會(huì)出現(xiàn)失真現(xiàn)象，且波幅較低。因此要使被測(cè)樣件中的所有橫通孔獲得更為一致的定量效果，需要使用不同的聚焦深度生成多個(gè)圖像。

在全聚焦方式（TFM）圖像（圖b）中，超聲聲束在每個(gè)像素上聚焦。可以看出，每一個(gè)橫通孔（SDH）的分辨率都非常好。雖然如此，我們還是可以觀察到，位于關(guān)注區(qū)域邊限處的橫通孔有些失真的現(xiàn)象。在相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）和全聚焦方式（TFM）檢測(cè)的常見聲束形成過(guò)程中，這些失真現(xiàn)象是固有的。

全聚焦方式（TFM）與相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）的討論綜述
全聚焦方式（TFM）的主要優(yōu)點(diǎn)是整個(gè)圖像都以聚焦的分辨率顯示，而相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）圖像僅在聲束的聚焦區(qū)域中具有較高的分辨率。

僅在傳統(tǒng)相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）的接收階段進(jìn)行的合成聲束形成，也會(huì)在全聚焦方式（TFM）檢測(cè)的發(fā)射階段進(jìn)行，以使采集速率適用于無(wú)損檢測(cè)（NDT）應(yīng)用。合成聲束形成需要對(duì)通過(guò)全矩陣捕獲（FMC）獲得的基本A掃描應(yīng)用特定的延遲。注意，全矩陣捕獲（FMC）數(shù)據(jù)集可以為任何檢測(cè)的合成聲束形成提供基本數(shù)據(jù)，包括相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）和全聚焦方式（TFM）檢測(cè)。

由于需要處理大量的全矩陣捕獲（FMC）數(shù)據(jù)才能生成全聚焦方式（TFM）圖像，因此在使用相同孔徑的情況下，全聚焦方式（TFM）的檢測(cè)效率可能會(huì)低于相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）。

雖然全聚焦方式（TFM）圖像在整個(gè)關(guān)注區(qū)域內(nèi)高度聚焦，但是它仍然會(huì)受到阻礙相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）的相同的聲學(xué)局限性的影響。雖然在相控陣超聲檢測(cè)（PAUT）和全聚焦方式（TFM）中都會(huì)觀察到波幅的波動(dòng)和圖像失真現(xiàn)象，但是在全聚焦方式（TFM）檢測(cè)中，被測(cè)樣件中一組大小相同的散射體在圖像中會(huì)表現(xiàn)得更為一致。
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