人類對熒光蛋白的興趣可以追溯到公元一世紀，當時羅馬自然哲學家老普林尼^[1]（Gaius Plinius Secundus，公元 23 年-公元 79 年）描述了地中海中一種會發光的水母（Pulmo marinus）。在他眼中，這些動物發出的光如此強烈，幾乎可以用作火炬（Bohn，1855 年）。除了這種水母之外，還有大量其他生物因為在黑暗中發光而吸引了我們的注意。事實上，它們發光并不是為了吸引我們的眼球，而是為了與同類交流（如螢火蟲對其配偶施加拉力）、吸引獵物（如蛙魚）或嚇唬捕食者（如長尾烏賊）。這些迷人的生物中有一些生活在黑暗的世界--例如深海--在那里光是一種原始屬性。只有海洋的上層 200 米才有陽光，而在這一邊界之下，唯一存在的光照是由生活在那里的生物產生的。

利用化學發光和熒光發光，進化出了近代生物化學和細胞生物學中Z令人印象深刻和Z強大的工具之一。他們的努力和發現值得一提。

中世紀后，隨著人們對自然科學的興趣日漸濃厚，西班牙醫生兼植物學家尼古拉斯-莫納德斯（Nicolás Monardes）等人于 1565 年描述了一種由 Lignum nephriticum 提取物制成的會發光的木材。后來，這種光被歸因于這種植物中的一種黃酮類化合物的氧化產物，并表明發光不僅限于動物。三個多世紀后（1858 年），愛爾蘭數學家和物理學家喬治-加布里埃爾-斯托克斯為這種自然現象起了一個名字：熒光。他根據能發出藍光的礦物螢石想到了這個詞，并擴大了對輻射物體的觀察范圍，從動物到植物，再到石頭。

日本生物化學家下村治（Osamu Shimomura）是現代Z早開始系統探索熒光蛋白的研究人員之一。他與老普林尼一樣對熒光水母感興趣，并在 20 世紀 60 年代初將維多利亞水母（Aequorea victoria）確立為自己的 "心儀之物"。下村之所以對維多利亞水母如此著迷，是因為它能通過熒光發出綠光。它的棲息地在太平洋，以貝類和其他水母為食。這種光是由生物體底部呈環狀排列的所謂發光器官產生的。下村在畢業時曾對一些種蝦的熒光素進行過研究，他解剖了這些器官并用篩子擠壓，結果得到了微弱發光的漿液。通過對成千上萬只水母的研究，下村的努力得到了回報，他提取并純化出了化學發光蛋白aequorin^[2]。后來人們發現，aequorin之所以能發出藍光，是因為它在鈣依賴反應中作為熒光素酶參與了腔腸素的氧化過程。熒光素酶是一種在化學反應中氧化底物（熒光素）的酶，與光的發射有關。

然而，有一個令人費解的問題是，為什么在提取過程中發出的是藍光，而完整的生物體發出的卻是綠光？下村及其同事花了數年時間才解開這個謎團。但他們的研究Z終發現，來自aequorin的藍光只是另一種發光蛋白質--水母綠色熒光蛋白（GFP）--的能量來源。他們意識到，Aequorin發出的光被GFP吸收，GFP利用這些能量產生綠色熒光。

GFP 凱旋的下一個突破性步驟要等到 20 世紀 70 年代克隆技術的發明。1992 年，美國微生物學家 Douglas Prasher S次克隆出完整的 GFP 基因^[3]。在此之前，他與佐治亞大學的同事米爾頓-科米爾（Milton Cormier）一起準備了一個維多利亞甲蟲 cDNA 文庫，已經知道了 GFP 的前景。遺憾的是，在他開始在細菌中表達重組 GFP 之前，美國癌癥協會（American Cancer Society）對 Prashers 的資助就已經用完。

美國生物學家馬丁-查爾菲（Martin Chalfie）Z初懷疑 GFP 無法在水母之外發揮作用，但他從普拉舍的初步工作中獲益匪淺。通過將 GFP 基因導入大腸桿菌和線蟲 C. elegans，他可以證明沒有其他水母特有的蛋白質或因子可以產生綠光^[4]。

有了這些經驗，綠色熒光蛋白在生命科學領域開始了它驚人的事業。GFP 成為觀察活細胞和生物體結構的關鍵，而無需合成標簽或熒光抗體。在免疫熒光染色的情況下，必須保證抗體能夠進入細胞內的相應目標結構。要做到這一點，就必須用去污劑（例如）使細胞通透，這不可避免地會導致細胞死亡。此外，大多數抗體都偏愛變性抗原。因此，免疫熒光技術使用對羥基甲醛等制劑使細胞蛋白質目標結構變性。總之，GFP 的使用可以克服這些非生理條件，為生命細胞成像鋪平道路。

羅杰-錢（Roger Tsien）是另一位意識到并開發 GFP 巨大潛力的人。這位美國細胞生物學家來自鈣調節領域，他對追蹤活細胞內大分子的相互作用產生了濃厚的興趣。在哈佛大學、劍橋大學和伯克利大學學習和工作后，他Z終在加州大學圣地亞哥分校安頓下來。作為藥理學、化學和生物化學教授，他利用進化過程中一個非常普遍的原理，提高了 GFP 的效率：突變。1994 年，他和他的研究小組發現了一種 GFP 的單點突變體（S65T），其發光強度和光穩定性比野生型要好得多。除了發光更亮之外，S65T 突變體還有另一個顯著的技術優勢。野生型 GFP 在 395 納米和 475 納米有兩個激發Z大值，而突變型只有一個，即 484 納米。通過將其發射波長保持在 509 納米，"新 "GFP 的光譜特性幾乎符合經典的 FITC 熒光特性（FITCex：496 納米，FITCem：520-530 納米）。由于這種 GFP 變體具有增強功能，因此被稱為 "增強型 "GFP 或 EGFP。

通過對 GFP 的結構研究，Tsien 及其同事開發出了更多的熒光衍生物。他們掌握了 GFP 的結構，并確定了一種變體（T203Y），這種變體閃耀著明亮的黃色，因此被命名為 "黃色熒光蛋白 "或 YFP。隨后又出現了青色（CFP）和藍色（BFP）形式的熒光蛋白 ^[5]。

自 2003 年起擔任俄羅斯科學院通訊院士的生物化學家謝爾蓋-A-盧基揚諾夫（Sergey A. Lukyanov）在珊瑚中發現了紅色熒光蛋白^[7]，從而將熒光蛋白的顏色范圍擴展到了光譜的紅色范圍。盧基揚諾夫在莫斯科一家寵物店購買了一些珊瑚蟲后，對這些準備用于俄羅斯海洋水族館的原始動物的熒光行為進行了研究。其中，他從珊瑚蟲 Discosoma 中發現了一種紅色熒光蛋白，并將其命名為 DsRed。除了 DsRed，盧基揚諾夫和同事們還在擬水生動物中發現了一系列其他發光蛋白，并不斷對其進行優化，以用于生物化學研究。

研究人員在發現、理解和增強熒光蛋白方面所做的努力，為生命科學帶來了巨大的應用空間。GFP 及其變體為科學家觀察生物體內的轉移或血管生成等情況打開了大門。此外，熒光多色神經元（Brainbow）的使用將有助于了解大腦中復雜的神經元網絡。由于可以用熒光蛋白裝飾寄生蟲（如瘧疾病原體惡性瘧原蟲），因此可以觀察它們在宿主細胞中的命運。這樣的機會不勝枚舉，不僅包括臨床相關項目，還包括其他基礎科學項目。

GFP 及其突變體的使用極大地改變了我們對生命及其病理變化的看法，因此，參與發現和開發 GFP 的三人獲得了 2008 年諾貝爾化學獎。Osamu Shimomura、Martin Chalfie 和 Roger Y. Tsien 因其在 "發現和開發綠色熒光蛋白 GFP "方面的工作而獲得了科學界的Z高榮譽。

www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/

這段 2008 年諾貝爾化學獎頒獎詞的引文再次說明了熒光蛋白對當前生命科學的巨大影響，同時也引起了我們對未來應用的好奇。熒光蛋白（可光激活、可光開關或可光電轉換的熒光蛋白）的Z新發展以及超分辨率顯微鏡等新光學設備的建立都清楚地表明，熒光技術的發展仍在進行之中，離終結還很遙遠。

DMi8 S 模塊 INFINITY TIRF 全內反射熒光系統

DM4B & DM6B 正置雙目生物顯微鏡