本文深入探討了PIN-FORMED（PIN）類生長素轉(zhuǎn)運蛋白在運輸多種苯氧乙酸類除草劑方面的作用，并運用結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)方法詳細(xì)解析了這些化合物的底物特異性及轉(zhuǎn)運機(jī)制，從而為新型合成生長素和抗除草劑作物的研發(fā)奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。

**研究問題**：苯氧乙酸類除草劑是一類廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的重要合成生長素，但其在植物體內(nèi)分布所需的轉(zhuǎn)運蛋白身份尚未明確。這一問題的解決對于理解植物如何耐受這些化合物及開發(fā)更高效的除草劑或抗性作物至關(guān)重要。

- **研究難點**：盡管苯氧乙酸類除草劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用，但關(guān)于它們是否依賴于PIN類轉(zhuǎn)運蛋白進(jìn)行分布的問題，目前學(xué)術(shù)界仍存在較大爭議。此外，PIN轉(zhuǎn)運蛋白如何識別和容納合成生長素的化學(xué)多樣性，目前仍是一個未解之謎，這在一定程度上制約了精準(zhǔn)育種技術(shù)和新型除草劑設(shè)計的進(jìn)一步發(fā)展。

**文獻(xiàn)綜述**：已有研究表明，PIN類轉(zhuǎn)運蛋白是植物中極性生長素運輸?shù)年P(guān)鍵因子，負(fù)責(zé)將生長素從細(xì)胞質(zhì)輸出到細(xì)胞外。然而，關(guān)于苯氧乙酸類除草劑的轉(zhuǎn)運機(jī)制一直眾說紛紜。一方面，研究表明PIN介導(dǎo)的運輸受PIN抑制劑的影響，從而影響了這類化合物的分布；另一方面，也有研究指出苯氧乙酸可能通過被動擴(kuò)散機(jī)制而非蛋白介導(dǎo)的方式實現(xiàn)跨膜運輸。近年來，通過對擬南芥PIN8、PIN1和PIN3的結(jié)構(gòu)解析，科學(xué)家們揭示了轉(zhuǎn)運蛋白的同源二聚體結(jié)構(gòu)，并闡明了其獨特的電梯式轉(zhuǎn)運機(jī)制，這為深入理解底物的結(jié)合與轉(zhuǎn)運機(jī)制提供了寶貴的線索。

固相膜電生理學(xué)檢測：使用SURFE2RN1設(shè)備進(jìn)行固相膜電生理學(xué)檢測，以評估PIN8蛋白對不同底物的結(jié)合親和力。通過測定不同濃度底物對NPA誘導(dǎo)電流的抑制程度，確定了各底物的KD值。實驗過程中，關(guān)鍵步驟包括將新鮮純化的PIN8與不同底物混合，并在冰上孵育1小時后離心去除沉淀。所得樣品液滴冷凍后用于數(shù)據(jù)采集。

結(jié)構(gòu)與化學(xué)決定因素：通過SSM電生理學(xué)測量確定PIN8對不同底物的結(jié)合親和力，發(fā)現(xiàn)Asn117是協(xié)調(diào)羧酸鹽的關(guān)鍵殘基。N117A突變導(dǎo)致2,4-D和4-CPA功能完全喪失，S146A和Y150F突變則輕微減弱了IAA的底物親和力。Ser266直接協(xié)調(diào)4-Cl殘基，S266A突變降低了所有底物的親和力。

研究發(fā)現(xiàn)：研究表明，合成生長素如2,4-D和4-CPA通過PIN蛋白在植物體內(nèi)和體外運輸。

未來研究方向：未來的研究將聚焦于探索其他生長素除草劑是否同樣作為PIN的底物，并考察底物親和力的決定因素是否具備推廣至其他鹵代生長素除草劑的可能性。通過闡明底物親和力的決定因素，可識別具有更高系統(tǒng)流動性的新型生長素除草劑，用于農(nóng)業(yè)。

圖5 |苯氧乙酸的轉(zhuǎn)運和底物相互作用關(guān)鍵殘基的鑒定。a)由1mM基板引出的歸一化代表性電流跡線。灌注方案如圖所示。b)用于測定2,4- d KD的三個代表性溶液交換實驗的原始電流跡。為清楚起見，該圖僅顯示了用于獲得KD的三種濃度。灌注方案如圖所示。c)存在（▼）或不存在（?）PID時，卵母細(xì)胞中PIN3輸出[3h]-4-CPA的相對轉(zhuǎn)運率。初始內(nèi)部4-CPA濃度為1μM。數(shù)據(jù)點為不同雌性卵母細(xì)胞的平均±SE轉(zhuǎn)運率。各組間比較采用雙側(cè)未配對學(xué)生t檢驗（PIN3 vs PIN3 + PID, * P = 0.0.4101）。d)由SSM電生理學(xué)測定的LPR10（?）和LPR50（▲）的野生型PIN8蛋白脂質(zhì)體從2mM的指示底物上得到的峰值電流響應(yīng)的全寬度半最大值（FWHM）。數(shù)據(jù)為n = 3個單個傳感器的平均值±s.e.m.。各組間比較采用雙側(cè)未配對學(xué)生t檢驗(IAALPR10 vs . IAALPR50: **** P < 0.0001；2,4- dlpr10 vs 2,4- dlpr50: * P = 0.0148；4-CPALPR10 vs 4-CPALPR50: *** P = 0.0003；2-CPALPR10 vs 2-CPALPR50: * P = 0.0127；NPALPR10與NPALPR50: ** P = 0.0032)。e)與使用SSM電生理在PIN8 N117A蛋白脂質(zhì)體上使用100μM（?）或2mM（■）指示底物引發(fā)的WT相比，相對峰值電流響應(yīng)。數(shù)據(jù)為n = 3個單個傳感器的平均值±s.e.m.。兩種濃度的底物之間沒有顯著差異（單因素方差分析p = 0.3）。字母表示相同的顯著性水平。f) SSM電生理測定PIN8 N223A蛋白脂質(zhì)體的峰值電流響應(yīng)與[2-CPA]的關(guān)系。Michaelis-Menten模型適合描述動力學(xué)(r2 2?CPA = 0.98；Ec2 50?cpa 263±64μm；I 2 max?CPA 3±0.1 nA；數(shù)據(jù)點表示平均值±s.e.m；N = 3個獨立傳感器)