技術速遞丨使用Biozen dSEC -7色譜柱進行質粒線性化過程控制
概述
線性質粒在 mRNA 藥物生產的體外轉錄（IVT）中發揮重要作用（它們在此過程中作為 DNA 模板）。為此，需要產生具有所需序列的環狀質粒，并利用限制性內切酶將其轉化為線性質粒。這個過程需要以過程分析的形式進行質量控制。本文提出的尺寸排除色譜（SEC）分析被證明是一種適用于線性和環狀質粒的尺寸分離方法。
步驟 | 描述 |
樣品預處理 | 通過加入 20 μL 的 10 份 rCutSmart? 緩沖液（NEB?）、4 μL 的 AlwNI（NEB）和 116 μL 的水，在 37 ℃ 下孵育過夜，完成對 pUC-19 的線性化 |
加載 | 質粒純化柱（PCR 和 DNA 清理試劑盒，NEB），帶線性化的 pUC-19 樣品 |
清洗 | 使用清洗緩沖液清洗 2 次 |
洗脫 | 無 RNA 酶水 |
重構 | 用無 RNA 酶水稀釋至 0.1 mg/mL |
色譜柱：Biozen 3 μm dSEC-7
規格：150 x 4.6 mm
貨號：00F-4789-E0
流動相：2 x Phosphate Buffered Saline
流速：0.1 mL/min (Isocratic)
進樣量：3 μL
溫度：25 ℃
LC 系統：Vanquish? Duo UHPLC
檢測器：UV @ 260 nm
圖 1 顯示，線性化過程后沒有剩余的環狀或超螺旋 DNA。圖 2 顯示，線性 DNA 和環狀質粒以 1:3 的比例混合，以模擬不完全酶切的過程控制樣品。數據表明，環狀質粒和線性質粒之間的分離是可能的，并且可以使用 Biozen dSEC-7 柱進行線性化監測。
峰序號 | 分析物 | 保留時間（min） |
1 | 環狀 pUC19 | 9.375 |
2 | 超螺旋 pUC19 | 19.015 |
峰序號 | 分析物 | 保留時間（min） |
1 | 線性 pUC19 | 8.970 |
圖 1. 環狀 pUC19（上）和線性化后的色譜圖（下）
峰序號 | 分析物 | 保留時間（min） | 分離度 | |
1 | 線性 pUC19 | 8.938 | 1.02 | - |
2 | 環狀 pUC19 | 9.360 | 13.64 | |
3 | 超螺旋 pUC19 | 19.015 | - | |
圖 2. 不完全酶切狀態下模擬 pUC19 過程控制樣品的色譜圖
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