利用FluoTime光譜儀進行微體積熒光光譜測量

Eugeny Ermilov, Maria Loidolt-Krüger, Bita Rezania

PicoQuant GmbH, Rudower Chaussee 29, 12489 Berlin, Germany, info@picoquant.com

在科學研究和診斷中，效率、靈敏度和成本效益都很重要。對更精確結果的需求與日俱增，加上需要保存珍貴的患者樣本并盡量減少試劑的使用和浪費，這是對包括細胞培養和微生物學等跨學科實驗室的一場挑戰。

能夠精確檢測小容量樣本中低濃度分析物的高靈敏儀器有助于應對這些挑戰。在本應用說明中，我們使用 FluoTime 250 熒光壽命光譜儀展示了對微量熒光光譜和熒光壽命的測量。FluoTime 250熒光壽命光譜儀，可應用于一系列任務，包括核酸分析、蛋白質分析、熒光底物酶分析、熒光離子指示劑、代謝物定量和免疫分析。值得一提的是，FluoTime 300也可以進行同樣的實驗。

我們的方法強調盡量減少樣本消耗，確保細胞培養物、微生物培養物和患者樣本等珍貴樣本得到有效利用。此外，我們的方法旨在優化試劑的使用，同時不影響性能，從而降低與實驗室分析相關的總體成本。此外，我們的策略還優先考慮減少浪費，在保持實驗數據的質量的同時，促進實驗室的可持續發展。

在其他分析技術中，穩態和時間分辨熒光光譜可用于物質的鑒定、定量和純度評價。

穩態發射光譜的特點是操作簡單、應用廣泛。通過分析發射光譜，研究人員可以根據物質獨特的熒光特征對其進行識別。這種技術廣泛用于各種化合物的鑒定和檢測，包括熒光團標記的生物分子、環境污染物和藥物。

此外，發射光譜還是評估物質純度或材料質量的可靠工具。熒光光譜的差異可以表明樣品中存在污染物或結構的改變。

時間分辨熒光光譜技術是對穩態發射技術的一種復雜擴展。通過測量脈沖激發后熒光發射隨時間的衰減，研究人員可以提取有關樣品的動力學信息。

熒光壽命衰減是每種熒光團及其所處環境的特征，因此可用于識別和補充光譜信息。

此外，這種方法在涉及環境敏感的熒光團的應用中特別有價值，在這些應用中，環境的變化，如pH、溫度、各種離子濃度或粘度，會影響熒光壽命。通過利用熒光壽命對環境變化的敏感性，研究人員可以設計出能夠定量測量生物和環境樣品中離子濃度的傳感器。這種能力為具有時間分辨率的實時監測開辟了道路。

FluoTime 熒光壽命光譜儀系列（FluoTime 250 和 FluoTime 300）因為它使用方便、采集速度快、維護簡單，使這些技術的獲得更加容易。

所獲得的熒光素在乙醇中的熒光發射光譜如圖1所示。原始光譜（底部）清楚地顯示，與100 nM樣品相比，從稀釋4000倍的25 pM樣品中收集到的熒光信號大幅下降。然而，在405 nm的激發下，發射光譜的形狀非常相似，這一點可以在歸一化后看到（左上角）。這表明FluoTime 250具有極高的高靈敏度。

在440 nm激發后，在25 pM樣品的發射光譜中清晰可見一個約500 nm處的大拉曼峰（右上）。這就突出了選擇適當激發波長的實際必要性，以盡量減少熒光和拉曼信號的光譜重疊。幸運的是，FluoTime 250 提供了這種靈活的配置。

由于使用了脈沖激發激光和時間分辨檢測，我們還可以獲得熒光壽命。圖2顯示了兩種濃度的熒光素在405 nm（左）或440 nm（右）激發，并在516 nm處檢測的熒光衰減。我們可以對衰減進行尾部擬合或再卷積擬合，以獲得熒光壽命。熒光素在乙醇中的熒光壽命約為 4.3 ns。

在所有條件下測得的熒光壽命都非常吻合，這說明即使在低信號水平下，這種方法也是穩健可靠的。

在25 pM熒光素 采用440 nm激發后的熒光壽命衰減中，拉曼信號也是可見的，在衰減曲線的起始處急劇下降。通過進行再卷積擬合，在分析實驗數據時可以很容易地將這種效應作為“散射光 ”考慮在內。