冷凍電子斷層掃描技術(shù)(Cryo-ET)是一種透射電子顯微鏡(TEM)技術(shù)，該技術(shù)通過分析一系列傾轉(zhuǎn)圖像，對(duì)相對(duì)較薄體積的樣品（約200-300 nm厚）進(jìn)行成像。通過該技術(shù)，可以揭示蛋白質(zhì)的3D分子結(jié)構(gòu)。

隨著近十年來， cryo-FIB和cryo-TEM的樣品制備技術(shù)飛速發(fā)展，已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)部的天然環(huán)境中，使用cryo-ET技術(shù)解析蛋白質(zhì)和其他生物分子的結(jié)構(gòu)，分辨率可達(dá)到亞納米級(jí)。使用這種方法，細(xì)胞需要生長(zhǎng)在TEM載網(wǎng)上，再通過投入冷凍將樣品玻璃化，然后轉(zhuǎn)移至冷凍-FIB/SEM加工出小窗口（薄片）。隨后就可以使用cryo-TEM對(duì)薄片成像，獲得一系列傾轉(zhuǎn)圖像。細(xì)胞的成像窗口必須足夠薄，以便允許電子束穿透樣品。

然而，為了確定樣本中的特定點(diǎn)，需要對(duì)感興趣區(qū)域進(jìn)行高精度地定位。目前，這主要是通過冷凍共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行3D高精度成像實(shí)現(xiàn)的。共聚焦針孔能夠消除了離焦光線，特別是在軸向方向，從而提高分辨率和對(duì)比度。

在下文中，解釋了如何在低溫條件下使用LIGHTNING超分辨技術(shù)和TauSense基于熒光壽命的工具，使用熒光顯微鏡更好地辨別和識(shí)別目標(biāo)結(jié)構(gòu)，以便用于后續(xù)的電鏡工作流程。

盡管共聚焦顯微鏡提供了極好的3D掃描成像質(zhì)量，但在成像過程中仍然會(huì)發(fā)生衍射現(xiàn)象，從而限制成像的分辨率。該現(xiàn)象是每個(gè)成像系統(tǒng)設(shè)置的特征，可以描述為所謂的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)。該方法得到的圖像是樣本與成像系統(tǒng)的PSF和設(shè)定條件的卷積（折疊）。衍射現(xiàn)象會(huì)產(chǎn)生較為模糊的圖像，導(dǎo)致有效分辨率降低和每一個(gè)光子定位偏差。同時(shí)，樣品圖像還存在其他干擾信號(hào)，如背景和噪聲，影響從原始數(shù)據(jù)中獲得的信息。

然而，現(xiàn)在可以通過精密的模型，從樣品的離焦區(qū)域識(shí)別單個(gè)光子的干擾信號(hào)，然后通過與其原始位置的相關(guān)性對(duì)其進(jìn)行反卷積。通過這種方法可以獲得超分辨率圖像。

共聚焦顯微鏡的傳統(tǒng)反卷積方法，通常使用一個(gè)全局設(shè)置進(jìn)行圖像重建，該過程不考慮圖像中的不均勻性。因此，攜帶信息的信號(hào)可能被拒絕，而不需要的信號(hào)（如背景或噪聲）可能被錯(cuò)誤地解釋為信息。

另一方面，LIGHTNING技術(shù)包括位置依賴、精確體素的差異。這種自適應(yīng)過程能夠全自動(dòng)、準(zhǔn)確地恢復(fù)任何生物樣本的信息，即使在低溫條件下的成像結(jié)果（圖1）。

通過去除不需要的背景信號(hào)和噪聲，LIGHTNING技術(shù)能夠提高圖像質(zhì)量。在實(shí)際反卷積之前的預(yù)處理步驟中，需要確定全局背景值。根據(jù)實(shí)際局部信號(hào)和噪聲之間的比值，將全局背景微調(diào)至局部背景值中。噪聲可以根據(jù)其高空間頻率進(jìn)行識(shí)別，通過忽略噪聲可以更好地獲得攜帶有信息的信號(hào)。

圖2為使用標(biāo)準(zhǔn)共聚焦顯微鏡（上圖）和LIGHTNING超分辨共聚焦（下圖）拍攝的兩個(gè)代表性的癌細(xì)胞圖像，其中顯示了線粒體（綠色）、脂滴（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）。從對(duì)比結(jié)果中可以清楚地看到，LIGHTNING技術(shù)能夠去除背景和噪聲，獲得對(duì)比度較高的圖像，更容易識(shí)別和辨別目標(biāo)結(jié)構(gòu)。圖像質(zhì)量的明顯改善，使得識(shí)別后續(xù)相關(guān)步驟所需的目標(biāo)結(jié)構(gòu)變得更為容易。

當(dāng)在高倍鏡下成像時(shí)，LIGHTNING技術(shù)的影響更加明顯，如圖2所示的放大區(qū)域。

如區(qū)域1中的脂滴圖像所示，通過LIGHTNING技術(shù)能夠降低背景和噪聲，從而改善信號(hào)，更精確地定向觀察脂滴結(jié)構(gòu)。

在區(qū)域2中所觀察到的管狀結(jié)構(gòu)也得到相同的結(jié)果。LIGHTNING技術(shù)提高了線粒體膜的對(duì)比度，使管狀外觀更加清晰，不僅提高了定位效率，而且增強(qiáng)了CLEM光電關(guān)聯(lián)過程的精確度。

答案是肯定的。生成決策掩碼的過程基于通用圖像處理方法，因此是完全可量化的。整個(gè)流程中，沒有改變單個(gè)光子的強(qiáng)度或定位特征，以及光子計(jì)數(shù)信息。該流程僅從現(xiàn)有共聚焦數(shù)據(jù)中提取信息，不做任何修改。

無論是否使用自適應(yīng)方法，在重建過程中沒有局部和相對(duì)強(qiáng)度失真。通過使用自適應(yīng)的、基于決策掩模的方法，將產(chǎn)生偽影或丟失信息的概率降至Z低。

TauSense 技術(shù)是一個(gè)利用基于熒光壽命的信息的工具集。因此，它為理解細(xì)胞功能提供了額外的信息。此外，TauSense技術(shù)可以提高圖像質(zhì)量，并擴(kuò)展區(qū)分給定標(biāo)本中熒光基團(tuán)的能力。TauSense技術(shù)可在應(yīng)用與室溫樣品和冷凍玻璃化樣品。

熒光產(chǎn)生過程中存在一個(gè)內(nèi)在現(xiàn)象，即熒光基團(tuán)的激發(fā)與其光子發(fā)射之間具有特定時(shí)間間隔。因此，就可以利用脈沖激光激發(fā)樣品中的熒光基團(tuán)，測(cè)量探測(cè)器處的光子到達(dá)的時(shí)間（圖4）。

上述時(shí)間間隔被稱為熒光壽命。熒光壽命取決于熒光基團(tuán)種類及其微環(huán)境。將兩個(gè)（或多個(gè)）熒光源的貢獻(xiàn)進(jìn)行分開的能力，使TauSense技術(shù)成為生命科學(xué)的強(qiáng)大分析工具。使用TauSense技術(shù)，能夠確定光子的到達(dá)時(shí)間，并開發(fā)為一個(gè)額外的維度，允許觀察微環(huán)境變化和多通道熒光基團(tuán)。

TauSense計(jì)算每個(gè)獨(dú)立像素的平均到達(dá)時(shí)間(AAT)，并通過標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度圖像之外的不同顏色將其顯示為另一個(gè)維度。TauContrast具有特定的熒光壽命強(qiáng)度圖（LUT；圖5）。

藍(lán)色范圍顯示較短的AATs，紅色顯示較長(zhǎng)的值。因此，可以從圖像中立即直觀地區(qū)分不同的AATs。通常，反射和某些類型的自發(fā)熒光在1 ns以下用“較短”的AATs表示，而熒光蛋白產(chǎn)生的靶信號(hào)的AATS則在1 ns以上的“較長(zhǎng)”范圍內(nèi)。該結(jié)果能夠辨別、分離和去除圖像中干擾隨后光電關(guān)聯(lián)流程的信號(hào)。

可以使用熒光壽命分布來識(shí)別和區(qū)分不同熒光壽命的組分，例如樣品中的不同熒光標(biāo)記。利用TauScan，可以將這些分布掃描并分離成預(yù)定數(shù)量的時(shí)間窗（圖6）。

數(shù)字預(yù)設(shè)門后進(jìn)行多指數(shù)分量擬合，生成每一個(gè)組分到達(dá)時(shí)間分布的線視圖（圖6，底部）。這種分布使人們能夠以類似于熒光信號(hào)光譜分布的方式處理到達(dá)時(shí)間信息。

該方法能夠獲得信號(hào)的時(shí)間離散信息，然后根據(jù)光子通量中包含的到達(dá)時(shí)間信息，設(shè)定適當(dāng)?shù)臅r(shí)間窗口分割光子信號(hào)。在區(qū)分信號(hào)后，根據(jù)光子的空間編碼可獲得相應(yīng)的圖像。TauScan實(shí)驗(yàn)獲得的圖像是包含熒光壽命分布中時(shí)間離散信息（上文解釋的時(shí)間窗口）的強(qiáng)度圖像。

TauSeparation技術(shù)使用組分的熒光壽命分布，如TauScan所得的分布數(shù)據(jù)，以此分離樣品中的熒光物質(zhì)。用戶借助在線圖表決定Z具代表性的平均壽命組分的值。然后TauSeparation選擇合適的時(shí)間窗口，在單獨(dú)的圖像中顯示該組分（圖7）。這樣，即使是不能通過其光譜性質(zhì)區(qū)分的熒光基團(tuán)，也可以通過不同的熒光壽命強(qiáng)度圖顏色進(jìn)行分離和直觀的辨別。因此，該方法可以有效區(qū)分電子顯微鏡的目標(biāo)結(jié)構(gòu)，增加光電關(guān)聯(lián)工作流程的可靠性。

除了分離組分，人們還可以去除特定的時(shí)間范圍內(nèi)顯示的信息，這樣就可以進(jìn)一步區(qū)分目標(biāo)信號(hào)和非貢獻(xiàn)信號(hào)（圖8）。

對(duì)于電子顯微鏡工作流程而言，特別是應(yīng)用與載網(wǎng)上的低溫電鏡技術(shù)，有時(shí)可以觀察到碳層或樣品支撐層的自發(fā)熒光和反射信號(hào)。將TauGating技術(shù)應(yīng)用于相關(guān)通道可清除目標(biāo)熒光信號(hào)，因此增加了下游工藝（如FIB切割）定位精度。

LIGHTNING和TauSense這兩種模式都被完全集成到Coral Cryo 工作流程中（圖9）。

對(duì)于LIGHTNING技術(shù)而言，軟件提供了一個(gè)向?qū)Я鞒?/span>，指導(dǎo)用戶如何根據(jù)需要定義合適的設(shè)置（例如，更高的采集速度與更高分辨率）。這些相互關(guān)聯(lián)的參數(shù)會(huì)被自動(dòng)設(shè)定，以得到預(yù)期的高質(zhì)量圖像。

所有TauSense工具都直觀地嵌入到探測(cè)器設(shè)置中，可以通過雙擊鼠標(biāo)激活（圖9）。

STELLARIS 5 Cryo 共聚焦光學(xué)顯微鏡