生物大分子藥物目前主要包括治 療性蛋白藥物與核酸藥物等，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，生物大分子已被普遍用以治 療腫瘤、本身免疫系統(tǒng)疾病和遺傳代謝病等多種疾病。生物治 療藥物在臨床和商業(yè)上的成功引起了行業(yè)內(nèi)對其開發(fā)的日益重視，需要高質(zhì)量的生物分析來支持這些藥物的開發(fā)。

與常規(guī)藥物一樣，評估大分子藥物的安全性和有效性需要徹底了解其藥代動力學(xué)（PK）、藥效學(xué)（PD）、毒代動力學(xué)（TK）以及免疫原性等特征。在藥物與機體相互作用中，PK是研究機體對藥物的處置作用，而PD和TK是分別研究藥物對機體有益/有害的效應(yīng)。PD/PK和PK/TK的相互關(guān)系是藥物藥理學(xué)評價的核心。FDA、NMPA等監(jiān)管機構(gòu)要求藥物進入臨床前必須證明其有效性和安全性，臨床前和臨床研究均需要研究藥物的PK，同時FDA建議對免疫原性風(fēng)險檢測Z 好在IND階段和臨床I期開展。因此，建立好的PD/PK/TK等生物分析方案對于大分子藥物的臨床前及臨床分析評價極為重要。

與小分子藥物相比，大分子藥物具有分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、細(xì)胞外基質(zhì)不容易透過、使用量低、身體易溶解等特性，其生物分析充滿挑戰(zhàn)。

生物大分子藥物與傳統(tǒng)小分子藥物的藥代動力學(xué)

特征比較（藥學(xué)進展 ，2018年8期 ）

傳統(tǒng)的生物分析方法通常依賴于基于小分子檢測的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)和基于生物制劑的配體結(jié)合分析（ligand-binding assay，LBA)），目前這兩種方法也用于抗體等生物藥的生物分析中。在現(xiàn)在的創(chuàng)新藥物中，還有mRNA、病毒載體、細(xì)胞治 療產(chǎn)品等，這些藥物本質(zhì)上并非蛋白質(zhì)藥物，因此qPCR、流式細(xì)胞術(shù)、成像技術(shù)等手段也越來越多地用于生物藥的生物分析中。

01、基于配體結(jié)合分析

生物分析中基于配體結(jié)合分析LBA是一種常用的分析工具，用于根據(jù)與其他生物分子的相互結(jié)合作用（binding interaction），定量測定生物分子（目標(biāo)分析物，Analyte）在生物體液中的濃度，主要包括酶聯(lián)免疫(ELISA)等。

目前ELISA是生物制藥行業(yè)使用Z廣泛的配體結(jié)合式（LBA）檢測平臺，它一直以來都是蛋白質(zhì)定量分析Z常用的技術(shù)，現(xiàn)在大多數(shù)生物標(biāo)志物的商業(yè)檢測試劑盒都是基于ELISA的。這項技術(shù)對于某些臨床前生物分析的應(yīng)用仍然很有吸引力，比如血清單克隆抗體的PK。但是ELISA操作復(fù)雜、測試運行時間長，采用自動化平臺可縮短分析人員操作的時間， 提高工作效率。

丹納赫生命科學(xué)旗下貝克曼庫爾特的Biomek i7自動化工作站結(jié)合美谷分子儀器的SpectraMax i3 多功能酶標(biāo)儀，可以自動化地對樣本進行高通量的ELISA操作，大大避免實驗誤差及重復(fù)的人工勞動。

自動化工作站進行ELISA實驗流程

自動化工作站進行ELISA實驗的結(jié)果

02、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測系統(tǒng)LC-MS/MS

與LBA 相比，LC-MS/MS 在生物分析中的優(yōu)勢在于可以提供快速的方法開發(fā)和驗證、高特異性和高重現(xiàn)性，還可以實現(xiàn)多種分析物同時定量。另外，LC-MS/MS 方法也更容易在不同的分析物類別和基質(zhì)之間轉(zhuǎn)移。但是靈敏度、樣品制備、方法開發(fā)和定量準(zhǔn)確度相關(guān)的難題也亟需解決。

丹納赫生命科學(xué)旗下SCIEX開發(fā)了一種通用的混合LBA和LC-MS/MS兩種技術(shù)的工作流程，該工作流程結(jié)合了這兩種技術(shù)的優(yōu)勢，可用于蛋白質(zhì)藥物的PK分析。該方法檢測阿達(dá)木單抗在小鼠血漿中的濃度，先用磁珠方法進行免疫親和性樣品的制備，然后將阿巴利單抗標(biāo)準(zhǔn)品進行消化后進入TripleTOF? MS系統(tǒng)進行肽圖譜分析，用以選擇蛋白質(zhì)定量的特征性肽段。在QTRAP 6500+系統(tǒng)進行定量分析后，50 到 10000 ng/mL 的線性關(guān)系可達(dá)0.99763，定量限為50 ng/mL。

LC-MS/MS方法的前處理流程

阿達(dá)木單抗的提取離子色譜圖   

SCIEX QTRAP? 6500+ 系統(tǒng)

03、qPCR技術(shù)

qPCR法是常用的分析核酸藥物表達(dá)量的一種方法，其定量下限可以達(dá)到pg/mL甚至fg/mL，這可以極大增強藥物在體內(nèi)暴露的檢測時間。此外，RT-qPCR使用的樣本量極少，只需要幾微升血漿樣本或1毫克組織即可滿足分析需求，減少了對珍貴樣本的使用，而且能夠使用384孔板實現(xiàn)對樣本的高通量分析。然而獲得信號特異、低背景的qPCR結(jié)果也非易事，丹納赫生命科學(xué)旗下IDT埃德特的雙淬滅熒光探針，在靠近報告基團9bp左右的位置增加一個中間淬滅基團，為FRET作用中提供了一個能量的“中轉(zhuǎn)站”，拉近了能量傳遞中每個基團間的距離，從而提高了熒光淬滅率降低了背景信號。

IDT 雙淬滅熒光探針示意圖

（藍(lán)色序列片段即為雙淬滅熒光探針）

在過去20年中，新型治 療方式的出現(xiàn)改變了生物分析領(lǐng)域的現(xiàn)狀，導(dǎo)致了一系列技術(shù)的發(fā)展和成熟。在發(fā)現(xiàn)階段以及藥物開發(fā)的臨床前和臨床階段，健全的生物分析方法非常重要，這將有助于開發(fā)更安全、更有效的藥物，同時減少開發(fā)的時間和成本。丹納赫生命科學(xué)一系列先進的生物分析工具和方法能夠有效幫助應(yīng)對創(chuàng)新藥物復(fù)雜結(jié)構(gòu)和不同作用機制對PK、PD和免疫原性評估提出的重大挑戰(zhàn)。