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  紅豆寄予誰 2017-10-07 00:00:00

  有限稀釋法是一種常用的克隆方法。 將需要再克隆的細胞株自培養孔內吸出并作細胞計數，計出1mL的細胞數。 用HT培養液稀釋， 使細胞濃度為50～60個/mL，于96孔培養板中每孔加0.1mL(五六個細胞/孔)。 接種2排，剩余細胞懸液用HT培養液作倍比稀釋，再接種2排，如此類推，直至使每孔含0.5～1個細胞。 培養7～10d后，選擇單個克隆生長的陽性孔再一次進行克隆。一般需要如此重復3～5次，直至達100％陽性孔率時即可，以確保抗體由單個克隆所產生。 例如： 實驗細胞克隆化培養技術—有限稀釋法 一、實驗目的： 1、掌握用有限稀釋法進行細胞克隆化培養技術； 2、學會細胞克隆形成的辯觀察技能； 3、配合抗體分泌細胞篩選技術，確定抗體分泌細胞。 二、實驗原理： 克隆化培養即單細胞培養技術，用有限稀釋法進行雜交瘤細胞克隆化培養，可以及時確定陽性雜交瘤細胞株，同時淘汰因發生染色體丟失或抗體的輕、重鏈基因分離而出現無抗體分泌陰性細胞株。 一般雜交瘤細胞需經過52—3次反復克隆后，才能達到細胞陽性率。 該辦法亦適用于一般細胞培養中的細胞純化、突變細胞株的選擇，識別和分離。是細胞株的常用方法。 三、實驗材料： 雜交瘤細胞、25毫升培養瓶、96孔細胞培養板（天津有機玻璃廠）、移液管（1毫升、5毫升、10毫升）、彎頭滴管、倒置顯微鏡、CO2培養箱、白細胞計數板、計數器、蓋玻片、防水筆、RPMI-1640、小牛血清、青鏈霉素、10毫升刻度離心管，00橡膠塞，飼養細胞（3-6×105/ml、見腹腔細胞的制備）。 四、實驗步驟： 1、分裝了每孔0.1毫升腹腔細胞的96孔細胞培養板（可提前24小時準備就緒，置CO2培養箱中備用）； 2、自細胞培養瓶中收集長勢良好的雜交瘤細胞（亦可自24孔培養板孔中收集），制成懸液。 3、按白細胞計數方法準確計得細胞懸液的細胞數，一般在105/毫升左右。 4、取3支10毫升刻度離心管排列在超凈工作臺試管架上，先用無血清培養基將細胞稀釋至103/毫升，再用含15%小牛血清的完全培養基稀釋到101/毫升細胞，即每0.1毫升1個細胞。 5、每孔0.1毫升細胞懸液。 6、置37℃5%CO2培養箱，4天后取出觀察，并在板蓋上打上標記，做好記錄并統計結果。 7、繼續培養時，則在第4-5天更換1/2培養基，約第7-9天可以收獲培養液上清用于檢測抗體。并重復檢測1-2次。 8、選擇單克隆生長孔，生長良好，陽性強者，轉移到24孔板再做克隆經培養或擴大培養。 五、實驗結果： 實驗結果以總細胞孔（如96孔）中出現克隆孔統計出克隆百分率，并可進一步按單細胞孔、雙細胞孔、多細胞孔分別計算出百分率。 六、注意事項： 1、注意無菌操作，一旦發現污染（孔）必須及時處理； 2、計數細胞要求準確，稀釋量亦要準確，否則將造成一孔多細胞克隆或克隆百分離太低； 3、在計數克隆出現率之前，不宜更換培養液，也不宜強烈振動培養板； 4、做克隆化培養的小牛血清必須是優質血清； 5、若做克隆抗體檢測時，特別要保護細胞的生長狀況，防止細胞生長不良甚至丟失。 七、說明： 哺乳動物細胞通過分離、稀釋接種，培養在適宜于單細胞生長的培養液中，形成細胞克隆。運用這項技術可以制作細胞成活曲線，即在接種相同數量細胞的培養瓶中，加入不同濃度的化學品，或照以不同劑量的射線，觀察其對細胞的聽見害程度。由此可以在哺乳類細胞中進行誘變試驗及分離突變細胞。

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