ELISA實驗原理：ELISA的原理、類型及操作步驟

　　ELISA的原理

　　ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。

　　ELISA方法類型和操作步驟

　　elisa可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。

　　(一)雙抗體夾心法

　　雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：

　　(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。

　　(2)加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。

　　(3)加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。

　　(4)加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

　　根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。

　　(二)雙位點一步法

　　在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

　　在一步法測定中，應注意鉤狀效應(hookeffect)，類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低于實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。

　　(三)間接法測抗體

　　間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

　　(1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。

　　(2)加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由于不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。

　　(3)加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接dibiao記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。

　　(4)加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。

　　本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。

　　(四)競爭法

　　競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

　　(1)將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

　　(2)待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫后，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。

　　(3)加底物顯色：參考管中由于結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。

　　(五)捕獲法測IgM抗體

　　血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。操作步驟如下：

　　(1)將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。

　　(2)加入稀釋的血清標本：保溫反應后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。

　　(3)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。

　　(4)加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。

　　(5)加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。

　　(六)應用親和素和生物素的ELISA

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MXD-02摩擦系數儀專業用于測量塑料薄膜和薄片、橡膠、紙張、紙板、編織袋、織物風格、通信電纜光纜用金屬材料復合帶、輸送帶、木材、涂層、剎車片、雨刷、鞋材、輪胎等材料滑動時的靜摩擦系數和動摩擦系數，通過測量材料的摩擦系數（或爽滑性），可以控制調節材料生產質量工藝指標，滿足產品使用要求。另外還可用于化妝品、滴眼液等日化用品的滑爽性能測定。

測試標準

該設備滿足多項國家和國際標準：GB/T 10006、ISO 8295、ASTM D1894、TAPPI T816

工作原理

將樣品裁為兩塊，其中一塊放在工作臺上用夾樣器夾住，另一塊包住滑塊，然后將滑塊安放在傳感器的掛孔上，使樣品在滑塊受到的重力下運動，也就是使兩試驗表面相對移動。傳感器所測得的力信號經過集成器ICL7650放大，送入記錄器，同時分別記錄動摩擦系數和靜摩擦系數。

實驗操作：

1、將一個試樣的試驗表面向上，平整地固定在試驗臺上。

2、試樣與試驗臺的長度方向應平行；將另一試樣的試驗表面向下，包住滑塊，用彈簧在滑塊****和后面固定試樣，如試樣較厚或剛性較大，有可能產生彎曲力矩使壓力分布不勻時，應使用63mm×63mm 尺寸的試樣。

3、連接電源線，按下“電源”鍵，靜置30S，儀器進入測力系統。

4、按“返回”鍵讓傳感器回到初始位置。

將固定有試樣的滑塊無沖擊地放在試驗臺的試樣中央，掛到傳感器的掛孔中，并使兩試樣的試驗方向與滑動方向平行且測力系統恰好不受力；

5、打開操作軟件；（脫機操作時此步省略）

6、兩試樣接觸后靜止15S，按“運行”，儀器運行使兩試樣相對移動，到終點時，記錄測試值。

7、如在靜摩擦力之后出現力值振蕩（原因為滑塊跳動），則不能測量動摩擦力，此時應取下傳感器上的彈簧進行測量；

8、取下滑塊后按“返回”清零，傳感器回到初始位置，進行下一組實驗；

9、試驗完成關閉儀器電源即可

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