【應用推薦】如何在3D培養的細胞中，對多個基因進行高通量定量分析？

2024-04-28 10:00:09 48閱讀次數

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近年來3D培養和細胞研究越來越熱，大家對這塊研究方向也越來越多樣。本次應用推薦，小編帶來的是Sujoy Lahiri等的《應用QuantiGene Plex對3D培養的原代人肝細胞球中ADME基因表達的定量分析》實驗研究解析。

在藥物研發過程中，確定藥物在肝臟中誘導代謝酶的產生情況是其中的關鍵環節。原代人肝細胞(Primary Human Hepatocytes，PHH)是研究肝臟生物學、肝功能和藥物誘導肝毒性的體外模型的金標準。然而，在傳統的二維(2D)單層培養中生長的PHH會迅速去分化并在一周內失去肝臟特異性功能。而Z近快速發展的三維(3D)細胞球培養可以模擬肝臟微環境并維持肝臟功能至少5周。因此，3D體外模型已被證明能更準確地反映體內肝臟生物學特征¹。

在本研究中，我們使用QuantiGene Plex檢測了PHH培養的3D細胞球中42個與藥物吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）和排泄（excretion）相關的基因(ADME)。其中3個標志物是核受體通路的關鍵標志物，通常用于鑒定對肝臟功能和代謝有誘導作用的因素：1)CYP1A2可激活芳香烴受體(AhR)激活，2)CYP2B6參與組成型雄甾烷受體(CAR)， 3) CYP3A4作用于孕甾烷受體(PXR)。然而，我們需要對ADME基因信號通路進行更廣泛的評估，這有可能對于表征藥物-藥物相互作用及對臨床結果的預測2有更好的指導作用²。

材料和方法

3D細胞球培養

采用Gibco? cryopreserved spheroid–qualified human hepatocytes進行實驗(Cat. No. HMCPSQ) ，依照user Guide³實驗操作指南進行操作。每孔接種3000個PHH細胞。細胞在接種后在5天內形成細胞球。從第5天開始，每48 ~ 72小時半量更換培養液1次。另外3D培養第5天，取培養的PHH 細胞在在包被了I型膠原蛋白24孔板中開始進行2D培養。操作步驟參見User manual⁴。

用原型配體誘導3個通常與肝內藥物代謝相關的主要的核受體通路。

將3D、2D培養所得細胞分別用50 μM奧美拉唑(AhR配體)，1 mM苯巴比妥(CAR配體)，10 μM利福平(PXR配體)或DMSO(溶媒對照)進行處理。在第2天和第3天處理2D培養細胞，而3D培養的細胞在第6天和第7天處理(圖1)。

圖1. 培養5天后，原代人肝細胞形成成3D 細胞球

將Gibco? cryopreserved spheroid–qualified human hepatocytes(Cat. No. HMCPSQ)接種在Nunclon? Sphera?低附U形底96孔微孔板中(Cat. No.174925) ，在培養5天后形成3D細胞球。在第6-7天用Cytochrome P450 (CYP)處理細胞球。在第8天使用QuantiGene樣品處理試劑盒QuantiGene sample processing kit (Cat. No. QS0100) 將細胞裂解。

QuantigenPlex

Invitrogen? QuantiGene? Plex分析提供一種準確精密的多重基因表達定量方法。QuantiGene Plex檢測使用Luminex? xMAP?技術，可在96孔板上的單個反應孔中同時測定3-80種mRNA。QuantiGene Plex分析還整合了西門子的分支DNA（bDNA）技術。該技術通過信號放大（而非模板放大）實現對RNA轉錄本的直接測定。

應用Quantigen Plex檢測法對定制的57個基因進行定量檢測，其中包括42個ADME基因，7個凋亡基因和8個管家基因(表1)。

靶標特異性的Capture Extenders（CE）和“ZZ”Label extender（LE）與細胞裂解液和Luminex?MagPlex磁珠在54℃下孵育過夜。磁珠表面包被有捕獲探針（capture probes），可特異地與CE雜交。通過這種雜交方式，每顆磁珠都與特定的目標基因雜交(原理示意圖如圖2所示)。過夜孵育之后，通過單鏈DNA寡核苷酸在50℃下依次進行的3輪雜交，每輪孵育1小時，分別雜交得到“前體放大信號”、“放大信號”和“標簽探針信號”，從而形成了分枝DNA信號放大的那棵“信號樹”。每輪雜交之前珠子需經過充分洗滌。標簽探針寡核苷酸被生物素化，在第三輪雜交并清洗后，將磁珠與檢測試劑鏈親和素植紅蛋白(SAPE)在室溫下孵育30分鐘。Z后，將磁珠充分洗滌后，在SAPE緩沖液中重懸，并在3D Luminex?儀器FlexMAP上讀取數據。

對于讀取的數據，賽默飛官網提供的了分析軟件，QuantiGene分析軟件整合了Transcriptome Analysis Console 4.0.2，可在賽默飛官網登錄，(apps.thermofisher.com/apps/quantigene) 。

圖2. QuantiGene Plex Workflow

表1. ADME genes = Green, Apoptosis genes = Blue, HSK genes = Yellow

檢測結果

圖3. 分別用QuantiGenePlex和PCR技術定量檢測PHH 3D細胞球，結果顯示基因表達升高

用QuantiGene Plex(QGP)和實時定量PCR技術，分別檢測3個批次的PHH樣品(Hu186X, Hu828X和Hu826X)中CYP3A4和CYP2D6 mRNA表達水平。然后對靶基因表達水平與管家基因的幾何熒光平均值進行歸一化。計算3D培養的細胞與2D培養5天的細胞基因表達水平的倍數變化(Δ)。

比較各批次的3D PHH細胞與相對應的2D細胞轉錄本的表達水平，QGP與PCR檢測結果具有良好的相關性。

圖4. 原型誘導劑誘導后，檢測ADME基因分別在2D和3D 培養的PHH細胞中的表達

火山圖顯示，奧美拉唑、苯巴比妥和利福平處理的Hu828X PHH細胞，與DMSO對照比較，基因表達水平有log2 fold的變化(p值<0.05，單因素方差分析)。基因上調>2倍的用紅色標出，基因表達下調>的2倍用綠色標出。3種配體誘導后，2D和3D 培養PHH細胞的基因表達譜有顯著差異。

圖5. ADME基因在每種誘導劑誘導下發生特異性的差異性表達

維恩圖顯示了Hu828X和Hu826X PHH樣本3D培養的細胞球在不同誘導劑的處理后，共同表達的基因(交集部分)和處理特異性差異表達的基因(無重疊的部分)。所列基因的Log2倍變化>2 (p值<0.05，單因素方差分析)。CYP1A2，已知是AhR激活的標記物，被AhR配體奧美拉唑特異性上調。然而，分別用于CAR和PXR活化的標記物CYP2BP和CYP3A4可被所有3種配體上調。

圖6. Metapathway Biotransformation Phase I and II

QuantiGene分析軟件可導出與Transcriptome Analysis Console (TAC)分析軟件兼容的.chp文件。TAC軟件不僅允許簡單地識別差異表達，還提供強大的交互式可視化結果。TAC搜索WikiPathway數據庫，允許在路徑圖上可視化數據，并計算路徑指標。Metapathway Biotransformation Phase I and II 被確定為3種配體誘導的主要通路。由利福平上調的基因以黃色高亮標出。

結論

應用Gibco? Hepatic Spheroid Kit(A41390)，Nunclon? Sphera?低吸附U-bottom 96-孔板和Gibco?培養基添加物，可將Gibco? Primary Human Hepatocytes (HMCPSQ)在5天內培養形成3D細胞球
QuantiGene Plex數據顯示，CYP3A和CYP2D在3D細胞球中的表達升高，這與通過實時定量PCR分析獲得的基因表達數據趨于一致。
在用原型配體誘導后，ADME基因表達的變化在2D和3D 培養的PHH 細胞之間有顯著差異。
通過ADME信號通路分析和二級標記以及/或特定基因的鑒定特征，可以提供更加全面的肝臟藥物相互作用特征。

下一步方向