產品簡介

DAF-FM DA即4-Amino-5-Methylamino-2',7'-Difluorofluorescein Diacetate，也稱DAF-FM Diacetate，是最新一代用于一氧化氮（nitric oxide, NO）定量檢測的探針，其檢測原理為：DAF-FM DA可以穿過活細胞膜（cell-permeable），進入細胞后可以被胞漿內的酯酶催化形成不能穿過細胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身僅有很弱的熒光，光量子約0.005，但在與NO反應后生成熒光素-苯駢三氮唑（benzotriazole），發強烈綠色熒光，光量子約0.81。Ex~495 nm，Em~515 nm。任何可以檢測熒光素（fluorescein）的儀器，包括熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、熒光分光光度計或熒光酶標儀都可以用于該熒光探針的檢測。

DAF-FM DA是最新一代NO檢測探針，與以往最成功且應用最廣泛的一氧化氮熒光檢測探針DAF-2 Diacetate相比較，具有多方面的改進：1）DAF-FM DA和NO加合反應形成的熒光產物在pH5.5以上不受pH影響；2）DAF-FM DA和NO加合反應形成的產物熒光更加穩定，不容易淬滅，這樣更加便于檢測；3）DAF-FM DA對一氧化氮的檢測靈敏度更高，其最低檢測濃度可達到3 nM，而DAF-2 Diacetate的最低檢測濃度約為5 nM。

本品適用于檢測細胞內的一氧化氮水平，推薦工作濃度為1-10 µM。如果收集細胞后再裝載探針，通常至少可以檢測100個樣品。

產品信息

貨號	40769ES50/40769ES76
規格	50 μg / 10×50 μg
外觀	白色粉末
CAS號	254109-22-3
分子式	C25H18F2N2O7
分子量	496.42
結構式
純度	＞98%

組分信息

儲存條件

-25~-15℃保存，有效期2年。

使用說明

1. 探針母液配置

用新鮮無水的DMSO溶解相應的質量的DAF-FMDA至給定濃度。

2. 細胞孵育

1）貼壁細胞

探針的推薦使用濃度為1-10 µM，初次使用需根據自身實驗體系來進行加載濃度。推薦按照1:1000比例，用DAF-FM DA稀釋液稀釋DAF-FM DA（5 mM），即終濃度為5 µM。去除細胞培養液，加入適當體積稀釋好的DAF-FM DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常情況下六孔板內單孔需要約1 mL的DAF-FM DA工作液，細胞濃度為1×10⁶-2×10⁷/mL。37℃孵育20 min。之后，PBS洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DAF-FM DA。

2）懸浮培養細胞。

按照1:1000比例，用DAF-FM DA稀釋液稀釋DAF-FM DA（5 mM），即終濃度為5 µM。細胞收集后，用稀釋好的DAF-FM DA重懸細胞，細胞濃度為1×10⁶-2×10⁷/mL，37℃孵育20 min。上述操作可以在離心管內進行。每隔3-5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。PBS洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DAF-FM DA。直接用適當的陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后再刺激細胞。

3. 檢測

1）對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡或普通的熒光顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

2）對于收集細胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，也可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

3）參數設置

使用Ex=495 nm，Em=515 nm，實時、逐時間點或單時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DAF-FM和 NO反應產物的熒光光譜和熒光素（fluorescein）非常相似，可以用檢測熒光素（fluorescein）的參數設置進行檢測，也可用檢測FITC的參數設置進行檢測。

注意事項

1.對于刺激時間較短（通常為2 h以內）的細胞，先裝載探針，后用適當的陽性對照及自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長（通常為6 h以上）的細胞，先用適當的陽性對照及自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。

2.DAF-FM DA探針的推薦使用濃度為1-10 µM，初次使用需根據自身實驗體系來進行加載濃度，孵育時間和溫度的優化。原則上來說，以最低濃度探針檢測且產生足量信噪比的熒光信號為宜。另縮短孵育時間可減少亞細胞區室化現象。

3.以下步驟使用的工作濃度（1:1000倍稀釋，即5 µM）和孵育時間（37℃，20 min）僅做為參考，可根據實際情況來調整。比如，對于某些細胞，如果發現未被刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可降低DAF-FM DA的加載濃度至1-2.5 µM。相反，如果發現用感興趣的藥物刺激后熒光較弱，可升高DAF-FM DA的加載濃度為10 µM，以提高檢測的靈敏度。另外，探針裝載的時間也可以根據情況在15-60 min內適當進行調整，孵育溫度在4℃-37℃內調整。

Ver.CN20240412