產(chǎn)品應(yīng)用 | Bigfoot分選流式用于iPSC單克隆分選，助力高質(zhì)量細(xì)胞突變模型方法建立
來自馬薩諸塞州總醫(yī)院研究團(tuán)隊(duì)的研究成果刊登于2024年年初Cell Reports Methods中，作者使用piggyBac轉(zhuǎn)座子遞送CRISPR文庫從而建立了新的的突變模型構(gòu)建方法。
新技術(shù)和大規(guī)模隊(duì)列研究使新的變異株能夠在未經(jīng)證實(shí)的范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)和關(guān)聯(lián)，但這些變異株的功能特征對(duì)于破譯疾病仍然至關(guān)重要。有助于對(duì)感興趣的細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）并行基因編輯的方法已經(jīng)成為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵工具。本文中，作者開發(fā)了一種方法，將CRISPR-Cas9 guideRNAs（gRNA）文庫和誘導(dǎo)型Cas9一起整合成一個(gè)piggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，構(gòu)建數(shù)十到數(shù)百個(gè)基因組突變體。這種方法通過引入插入或缺失（indel）和拷貝數(shù)變異（CNVs），盡管產(chǎn)生特定的核苷酸變化可以進(jìn)行原始編輯。大規(guī)模快速建立高質(zhì)量突變模型的能力將有利于等位基因細(xì)胞集合的建立，并催化研究數(shù)百個(gè)基因和突變?cè)诎l(fā)育和疾病中作用的比較功能基因組研究的發(fā)展。
▲用于并行化基因組工程的PB系統(tǒng)
示意圖概述了PB系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)工作流程。（上）將gRNA文庫克隆到PB質(zhì)粒載體中。（中）通過PB轉(zhuǎn)座子細(xì)胞傳遞和移除CRISPR組件可實(shí)現(xiàn)多因子、時(shí)間控制編輯。（下）分離單細(xì)胞建立克隆化iPSC細(xì)胞系，使用MIPs進(jìn)行基因分型以鑒定突變模型。
本文的方法學(xué)中，專門提到利用流式進(jìn)行96孔板的單細(xì)胞分選，用于克隆的形成和篩選。作者使用了多種不同細(xì)胞分選設(shè)備、孔板包被基質(zhì)和克隆形成培養(yǎng)基的組合，最終發(fā)現(xiàn)最有效的分選組合使用了Bigfoot全光譜流式細(xì)胞分選儀將單細(xì)胞分選進(jìn)包被 rhLaminin-521和含有10% CloneR2 cloning supplement的培養(yǎng)基的方案。分選后的細(xì)胞經(jīng)過單克隆培養(yǎng)，單克隆DNA提取進(jìn)而進(jìn)行WGS分析。
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