規范性引用文件：

《GB/T 6682 分析實驗室用水規格和實驗方法》、《HJ 494 水質 采樣技術指導》、《HJ/T 91 地表水和污水監測技術規范》。

方法原理

滅菌處置后的廢水通過孔徑為 0.45 μm 的濾膜過濾，細菌和芽孢被截留在濾膜上，然后將濾膜置于酪氨酸選擇性培養基上，37℃培養 72 h～96 h，枯草芽孢桿菌黑色變種產生的酪氨酸酶可分解利用酪氨酸形成黑色素，產生黑色的特征菌落。對特征菌落進行染色鏡檢和生化試驗做進一步鑒定，枯草芽孢桿菌黑色變種為革蘭氏陽性芽孢桿菌，營養細胞呈桿狀，單個或呈短鏈狀排列，芽孢橢圓形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，還原硝酸鹽，水解淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。根據結果報告檢出或未檢出枯草芽孢桿菌黑色變種。

儀器和設備

采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的 500 ml 廣口玻璃瓶。

恒溫培養箱：允許溫度偏差 36℃±1℃。

高壓蒸汽滅菌器：121℃可調。

pH 計：準確到 0.1pH 單位，或更高精度。也可使用 pH 比色管或 pH 精密試紙。

顯微鏡：物鏡 10×倍、20×倍、40×倍，油鏡 100×倍，目鏡 10×倍或 15×倍。

分析天平：感量 0.0001 g。培養皿：直徑 90 mm。

過濾裝置：配有砂芯濾器和真空泵，抽濾壓力勿超過-50kPa。

接種環、鑷子。

移液管：1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可使用計量合格的可調式移液器。

量筒：100 ml。三角瓶：100 ml。酒精燈。

無菌操作設備：無菌室或超凈工作臺、生物安全柜。

注：移液管、采樣瓶、培養皿、三角瓶等玻璃器皿試驗前要按無菌操作要求包扎，高壓蒸汽滅菌器（7.3）121℃滅菌 20 min，烘干，備用。

樣品采集

點位布設及采樣頻次按照 HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相關規定執行。

采集微生物樣品時，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。

如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液（6.13），以除去活性氯對細菌的抑制作用（每 125 ml 容積加入 0.1 ml 的硫代硫酸鈉溶液）；如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.14），以消除干擾（每 125 ml 容積加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。

注：15.7 mg 硫代硫酸鈉（6.11）可去除樣品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據樣品實際活性氯量調整。

培養

用滅菌鑷子夾取濾膜移放在酪氨酸瓊脂培養基（6.1）上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應與培養基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后用石蠟質封口膜（6.17）封好培養皿，倒置培養皿，放入恒溫培養箱（7.2）內，36℃±1℃培養 72 h～96 h。培養 96 h 后，如培養基上未有菌落生長，則試驗終止；如培養基上有菌落生長，則挑取黑色的特征菌落于營養瓊脂培養基（6.2）上，36℃±1℃培養 24 h，待鑒定。同時將已挑菌落的酪氨酸瓊脂培養基培養皿儲存于 2℃～5℃，以備必要時復查。

注：菌落顏色無法判斷時，可再次劃線接種至酪氨酸瓊脂培養基（6.1）培養后觀察；若菌落為灰色或灰黑色，可適當延長培養時間后觀察，培養時間不超過 7d。

染色鏡檢

挑取可疑菌落（9.3），分別使用革蘭氏染色液（6.9）和芽孢染色液（6.10）染色，具體操作及結果觀察詳見附錄 B，若使用市售商品化試劑，則按說明書操作，然后鏡檢。左——革蘭氏染色；右——芽孢染色。圖 2 枯草芽孢桿菌黑色變種染色鏡檢圖

生化試驗

挑取特征菌落（9.3），分別接種到淀粉培養基（6.3）、硝酸鹽培養基（6.4）、甘油復紅肉湯培養基（6.5）、甘露糖生化培養基（6.6）、甘露醇生化培養基（6.7）和苦杏仁苷生化培養基（6.8）上，具體操作及結果觀察詳見附錄 B，若使用市售商品化培養基，則按說明書操作。