環磷酸腺苷（cAMP）是細胞內關鍵第二信使，可整合來自多種G蛋白偶聯受體（GPCR）的信號，在學習與記憶、藥物成癮、運動控制、免疫、腫瘤、代謝等過程中發揮重要作用?；罴毎突铙w水平的cAMP分子濃度變化的高時空分辨率熒光成像是解析cAMP信號通路及其生物學功能的重要基礎。因此，開發高靈敏的cAMP熒光探針成為研究復雜生物過程的關鍵。與非基因編碼探針（染料和材料類）相比，基因編碼探針具有低毒性、低背景、可遺傳、可定位特定細胞亞結構或特定細胞等優點，在生命科學基礎研究中具有無可比擬的優勢。然而，現有的50多個基因編碼的cAMP熒光探針要么靈敏度低（熒光變化Z

大只有1.5倍），要么熒光亮度較暗，很難監測活體中微弱的內源性cAMP變化，極大地限制了生理和病理狀態下cAMP分子調控機理和功能的研究。2022年9月12日，中國科學院深圳先進技術研究院醫工所儲軍課題組在國際知名期刊Nature Communications上發表了題為“A high-performance genetically encoded fluorescent indicator for in vivo cAMP imaging”的Z/新成果，展示了一種高性能基因編碼的cAMP熒光探針。在該工作中，研究人員利用基于晶體結構介導的理性設計和蛋白質定向進化技術，開發了一種基于“環化重排熒光蛋白”（circularly permuted fluorescent protein）的高性能基因編碼的cAMP綠色熒光探針(命名為G-Flamp1)。在活細胞內，該探針在單光子和雙光子激發下的Z 大熒光變化均達到了12倍，并且結合和解離的時間達到了0.2和0.087秒。利用雙光子顯微鏡和光纖記錄儀，在果蠅和小鼠等模式生物內，該探針可實時監測特定動物行為過程中特定神經元的cAMP信號的時空動力學變化。

深圳先進院儲軍研究員為該論文的通訊作者，深圳先進院助理研究員王亮博士及北京大學鄔春靈博士為該論文的共同第 一作者。該工作得到了北京大學李毓龍課題組、中國科學院神經科學研究所徐敏課題組和何杰課題組、中山大學附屬第五醫院陳守登課題組、美國堪薩斯州立大學Ho Leung Ng課題組、中國科學院深圳先進技術研究院路中華課題組和鄭煒課題組及華中科技大學高尚邦課題組等多個合作伙伴的大力支持。

為了開發適用于活體檢測的高靈敏度探針，研究人員將環化重排綠色熒光蛋白(cpGFP)插入細菌MlotiK1通道的cAMP結合結構域(mlCNBD)中。經過插入位點篩選、連接肽優化、熒光蛋白及感應模塊優化，得到了具有高亮度、高靈敏度、合適親和力和快響應速度等特征的高性能基因編碼cAMP綠色熒光探針G-Flamp1。非常有意思的是，晶體結構顯示G-Flamp1探針的連接肽具有獨一/無二的結構：其中一個連接肽是一個非常剛性的 β-strand 結構，這在其它晶體結構已知的環化重排熒光蛋白探針中是不存在的，為開發其它高性能探針提供了新思路和新方法。

在體外實驗中，結合/未結合cAMP的G-Flamp1有不同發色團環境。G-Flamp1在450nm(單光子)或者900-920nm(雙光子)激發下，動態范圍達Z 大，即ΔF/F0約為13。G-Flamp1與cAMP親和力適中，其解離常數Kd值為2.17μM。G-Flamp1可在亞秒時間分辨率上檢測cAMP動態變化。在培養細胞中，該探針均勻分布在細胞質和細胞核中，本底熒光亮度介于同類探針cAMPr和Flamindo2之間。G-Flamp1探針在活細胞中的動態范圍達到了12倍，是目前少數幾個動態范圍在10倍以上的熒光蛋白探針之一。同時該探針具有良好的特異性和可逆性(圖1)。

圖1 G-Flamp1探針在體外和培養細胞內的表征

隨后，研究人員將G-Flamp1探針應用于果蠅這一模式生物中。果蠅腦部蘑菇體(mushroom body)的Kenyon細胞中cAMP信號通路在氣味相關的記憶中發揮關鍵作用。作者首先獲取了Kenyon細胞中表達G-Flamp1探針的轉基因果蠅，然后利用雙光子進行成像，果蠅受到氣味或電擊刺激時，蘑菇體不同子區域呈現不一樣的cAMP信號時空變化(圖2)，暗示不同子區域可能在聯想性學習中起著相對獨立的作用。

圖2 不同刺激下果蠅Kenyon細胞中cAMP信號的變化

為驗證G-Flamp1探針在活體動物中檢測cAMP動態變化的實用性，研究人員利用腺相關病毒在小鼠運動皮層中共表達綠色G-Flamp1探針和紅色jRGECO1a鈣探針?；铙w雙光子成像揭示了跑步運動中細胞特異性的cAMP信號，其與鈣信號無明顯相關性(圖3)。這反映了小鼠運動時大腦皮層M1神經元反應的異質性。

圖3 運動過程中小鼠皮質神經元內cAMP信號的變化

Z后，研究人員在小鼠大腦深部的伏隔核（NAc）腦區中表達G-Flamp1探針，并利用光纖記錄聽覺巴甫洛夫條件反射任務中該腦區cAMP信號的變化。結果表明，隨著訓練的熟練，小鼠得到獎賞時cAMP信號幅度在降低，而聽到相應聲頻信號時cAMP信號幅度在升高(圖4)；該特性與多巴胺信號類似，暗示多巴胺釋放引起了cAMP信號。綜上，G-Flamp1探針的高信噪比和高時間分辨率能夠高靈敏檢測到活體小鼠中內源性cAMP信號的動態變化。

圖4 巴甫洛夫條件反射任務中小鼠NAc腦區cAMP信號的變化

綜上所述，該研究開發了一種適用于活體檢測的cAMP熒光探針，并初步揭示了果蠅和小鼠等模式生物在特定行為過程中特定神經元的cAMP信號變化的規律，為進一步理解cAMP信號的調控和功能奠定了基礎。與廣泛使用的鈣離子探針GCaMP相比，G-Flamp1才僅僅只是開始：目前已有幾十家國內外實驗室在使用G-Flamp1，未來將會有更多實驗室利用G-Flamp1來研究復雜的生物學問題。

在未來研究中，研究人員將進一步提高探針性能，開發適用于不同應用場景的下一代高靈敏cAMP探針，并利用其揭示活細胞和活體中cAMP信號的規律、調控機制及生物學功能。與此同時，結合高內涵藥物篩選平臺，上述探針也將嘗試應用于針對GPCR受體的藥物篩選，以期發現更多的具有臨床價值的GPCR藥物。

儲軍，研究員，博士生導師。中國科學院百人計劃A類。廣東省生物醫學光學影像技術重點實驗室副主任。2001年獲華中科技大學生物技術專業學士學位；2004年獲華中科技大學生物醫學工程專業碩士學位；2009年獲得華中科技大學生物醫學工程專業博士學位，2009-2015年分別在麻省大學阿莫斯特分校和斯坦福大學進行博士后研究。2015年加入中科院深圳先進技術研究院。研究方向為新型光學和光聲分子探針的開發、分子信號通路的光學成像和光遺傳學、分子診斷和藥物篩選等研究等。目前已主持2項國家自然科學基金面上項目、主持和參與2項國家重點研發計劃，并主持多項深圳市項目，在Nature Biotechnology、Nature Methods、Nature Communications、PNAS等國際知名雜志發表論文30余篇。申請15項發明專利，并授權7項。

課題組長期招收博士后、博/碩士生和研究助理，歡迎大家聯系，儲軍老師郵箱：jun.chu@siat.ac.cn。