許多藥物在藥物開發(fā)的后期階段由于不可接受的毒性作用而失敗。在臨床試驗中，藥物失敗的部分原因是用于篩選藥物候選物的預(yù)測模型不夠完善。而三維 (3D) 類器官顯示出可提高體外實驗預(yù)測準(zhǔn)確性的潛力，表明了在臨床前測試中使用類器官的潛在價值。

抗癌藥物最常見的副作用是其對腸道的毒性，這常常限制了用于治療患者的藥物劑量。利用三維 (3D) 類器官體外實驗有助于評估抗癌化合物的毒性效應(yīng)，并在藥物開發(fā)過程中提供關(guān)鍵信息。使用自動化高內(nèi)涵成像可提高檢測通量，并擴展關(guān)于毒性效應(yīng)的信息范圍，尤其是在涉及復(fù)雜的三維生物學(xué)模型時。本研究展示了如何利用高內(nèi)涵成像技術(shù)在腸類器官中評估和量化毒性效應(yīng)。

在本應(yīng)用說明中，我們介紹了一種用于評估毒性的方法，該方法利用在 Matrigel 膠中培養(yǎng)的三維 (3D) 小鼠腸類器官，測試了 10 種化合物的濃度依賴性表型效應(yīng)。

按照制造商推薦的操作流程，在??Matrigel?圓頂中使用 IntestiCult 培養(yǎng)基培養(yǎng) StemCell Technologies 的原代小鼠腸類器官。在類器官培養(yǎng)期間，每 24 小時進行一次自動化培養(yǎng)基更換和透射光成像監(jiān)測。經(jīng)過一段時間，類器官自我組織并形成了復(fù)雜的隱窩結(jié)構(gòu)，符合腸類器官的表型特征。為了進行毒性評估實驗，我們將類器官基質(zhì)圓頂接種到 96 孔板（Ibidi 板）中，每個圓頂含有 50% 的 Matrigel 基質(zhì)，體積為 15 μL，大約包含 60 個類器官。類器官通過手動或使用 CellXpress.ai 體外模型自動化工廠進行接種。在培養(yǎng) 48 小時后，向類器官中添加化合物。

除 staurosporine 從 20?μM 濃度開始外，其余化合物從 200 μM 濃度開始進行，采用 4 倍連續(xù)稀釋，共 7 個濃度。每個稀釋步驟將濃度降低到前一個濃度的 25%。此外，對照組用 0.1% DMSO 處理。類器官與化合物共培養(yǎng) 3 天?；?/span>合物處理后，類器官用 Hoechst 和 MitoTracker??Orange 染色，然后用 4% 多聚甲醛固定，并在 0.05%??TritonX 存在下用 Alexa488- Phalloidin 進一步染色。所有染料均來自 Thermo Scientific。

類器官使用 ImageXpress HCS.ai 智能高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)成像，采用共聚焦選項（60??μm 針孔）及 DAPI、FITC、TRITC三個熒光通道，并放大 10 倍。隨后，每個孔采集 3×3 個位點的圖像，以 10 倍放大倍率覆蓋整個類器官圓頂區(qū)域。此外，還使用 4 倍放大倍率拍攝了額外的圖像。利用 4 張拼接圖像覆蓋類器官圓頂區(qū)域。以 8??μm 間隔拍攝 16 張 Z 層圖像，覆蓋大約 120 μm 的 Z 軸范圍。使用最大投影二維圖像進行分析。

對于體積分析，則使用三維Z層圖像。

使用 IN??Carta 圖像分析進行圖像分析。在 IN??Carta 軟件中，通過自定義模塊編輯器 (Custom Module Editor, CME) 創(chuàng)建了一個多步驟分析 protocol，該 protocol 在投影圖像中使用 DAPI 通道（核染色）將類器官定義為斑點。分析最大強度投影圖像，測量了類器官的數(shù)量、平均類器官面積以及 DAPI（Hoechst 染色）、FITC（Alexa488 鬼筆環(huán)肽）和 TRITC (MitoTracker) 的平均類器官熒光強度。首先，使用高斯過濾器對 Hoechst 信號進行模糊處理，以便于對類器官圖像進行分割。隨后，對細(xì)胞核進行分割并用于定義細(xì)胞。接著，根據(jù) Phalloidin（肌動蛋白細(xì)胞骨架）或 MitoTracker（線粒體）的信號強度，將細(xì)胞標(biāo)記為陽性或陰性。利用對照樣本（未處理）和經(jīng)毒性化合物處理的樣本（如 ailuropodine），經(jīng)驗性地設(shè)定了陽性和陰性細(xì)胞標(biāo)記的閾值。肌動蛋白陽性或線粒體陽性的細(xì)胞分別被定義為具有完整的細(xì)胞骨架或完整的線粒體。對每個類器官中的陽性和陰性細(xì)胞進行計數(shù)，并測量陽性細(xì)胞的平均面積和平均強度。將類器官在三維空間中定義為體積對象，并通過自定義模塊進行 3D??CME 分析，從而評估類器官的平均體積。分析完成后，根據(jù)不同讀數(shù)的濃度依賴性繪制了四參數(shù)曲線擬合圖（針對 0.12–200 μM 的濃度范圍），以計算化合物毒性效應(yīng)的 EC50 值。SoftMax Pro 軟件用于曲線擬合和 EC50 值的計算。

我們對 10 種化合物進行了毒性效應(yīng)測試 。西沙必利 (Cisapride) 作為陰性對照，司托羅司 (staurosporine) 作為陽性對照?；衔镌?–200??μM的濃度范圍內(nèi)進行了4倍稀釋，實驗重復(fù)兩次或三次。毒性評估實驗采用96孔板形式進行。類器官培養(yǎng)使用CellXpress.ai體外模型自動化工廠進行設(shè)置（詳見應(yīng)用說明《利用健康腸類器官進行化合物毒性效應(yīng)的自動化測試》），也可手動進行設(shè)置。化合物處理3天后，類器官圓頂經(jīng)固定、染色和成像處理，具體步驟如“材料與方法”所述。類器官成像采用ImageXpress??HCS.ai??智能高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)，具體方法如“方法”部分所述。

圖1展示了經(jīng) Hoechst、MitoTracker 和 Phalloidin 染色的腸類器官的最大強度投影圖像雖然類器官在大小和復(fù)雜性上通常存在差異，但所有完整的類器官均顯示出強烈的肌動蛋白信號（綠色），表明細(xì)胞骨架完整，以及 MitoTracker 信號（橙 色），表明線粒體完整典型的腸類器官表型特征——腸隱窩也被觀察到。圖像分析確定了類器官圓頂中的類器官數(shù)量，并測量了類器官的大?。娣e）以及不同標(biāo)記物的熒光強度。此外，該分析還識別了單個細(xì)胞，并對類器官中的完整細(xì)胞和受損細(xì)胞進行了計數(shù)。

為了量化完整的細(xì)胞，我們將肌動蛋白或 MitoTracker 高信號的細(xì)胞標(biāo)記為陽性（即完整）。相反，肌動蛋白或線粒體染色較淺的細(xì)胞則被標(biāo)記為受損或死亡細(xì)胞。通過比較陽性樣本孔和陰性樣本孔，我們經(jīng)驗性地確定了陽性和陰性細(xì)胞之間的閾值。隨后，我們將這種分析方法應(yīng)用于整個培養(yǎng)板，包括那些用不同濃度化合物處理過的孔。4 倍放大倍率更適合捕捉整個類器官的表型，而 10 倍放大倍率下更高的核和細(xì)胞分辨率則有利于對不同標(biāo)記物的陽性和陰性細(xì)胞數(shù)量及百分比進行量化。類器官的密度對于結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要：較高的密度可以提供更好的統(tǒng)計基礎(chǔ)以進行量化，然而，如果接種過于密集，類器官會在圖像中重疊，從而導(dǎo)致類器官的分割（檢測）不準(zhǔn)確。

在我們的研究中，每個孔平均有 60.3±18.2 個類器官。經(jīng)過化合物處理的類器官表現(xiàn)出顯著的表型變化。

圖 2 展示了用 10 倍放大倍率拍攝的類器官圖像 。類器官的 形 狀 變 得 更 加 圓 潤 或 塌 陷?；?合 物 濃 度 的 增 加 導(dǎo) 致 Phalloidin 或 MitoTracker 染色減少。

然后，我們選擇了以下指標(biāo)來評估表型變化：每個類器官中肌動蛋白完整的細(xì)胞數(shù)量（肌動蛋白陽性細(xì)胞）；每個類器官中肌動蛋白陰性的細(xì)胞數(shù)量（受損細(xì)胞）；每個類器官中線粒體完整的細(xì)胞數(shù)量；肌動蛋白陽性細(xì)胞的總面積；平均細(xì)胞核強度；類器官的平均體積。基于細(xì)胞的分析和細(xì)胞計數(shù)的平均量化（每個類器官和每個孔）在毒性效應(yīng)的量化中最為高效。這種指標(biāo)的選擇使我們能夠量化毒性的不同方面：細(xì)胞骨架的解體/細(xì)胞死亡，或細(xì)胞骨架的塌陷（通過面積評估）；線粒體的完整性，DNA 的完整性（通過 Hoechst 染色評估）通過體積評估來判斷生長抑制/類器官塌陷。

我們創(chuàng)建了一條 CME 規(guī)則，該規(guī)則使用 Hoechst 染色找到類器官，然后定義單個細(xì)胞，并使用肌動蛋白和線粒體染色對細(xì)胞進行陽性和陰性評分。圖 3A 展示了 CME 分析的幾個步驟：使用核染料（DAPI 通道）來定義細(xì)胞核，使用肌動蛋白染色（FITC 通道）對細(xì)胞進行陽性和陰性評分。圖 3B 展示了類器官中肌動蛋白陽性和陰性細(xì)胞的分析掩膜。圖像分析顯示了處理樣本和未處理樣品之間的明顯差異，以及濃度依賴性的變化，包括完整細(xì)胞（活）或受影響細(xì)胞（陰性）的數(shù)量、具有完整線粒體的細(xì)胞、活細(xì)胞面積和細(xì)胞核強度。

柱狀圖（圖 4）展示了部分測試化合物的濃度依賴性變化。這些圖表也顯示了每個類器官中完整細(xì)胞（肌動蛋白染色陽性）的平均數(shù)量減少，以及受損或死亡細(xì)胞（肌動蛋白染色減弱）的數(shù)量減少。圖 A 顯示具有完整細(xì)胞骨架的細(xì)胞數(shù)量。圖 B 顯示每個類器官中肌動蛋白染色減弱的細(xì)胞數(shù)量。這種表型與受損或死亡細(xì)胞一致。注意，在化合物濃度極高時，這一數(shù)字的減少表明細(xì)胞顯然已經(jīng)解體，不再被核染色檢測到。此外，對于幾種 DNA 嵌合劑，尤其是阿霉素和阿糖胞苷，我們觀察到核染色的減少。圖 C 顯示核強度的劑量依賴性降低。我們還檢測了每個類器官中具有完整線粒體的細(xì)胞數(shù)量。隨著藥物濃度的增加，線粒體陽性細(xì)胞的數(shù)量減少。我們還使用核染色評估了類器官的平均體積。有趣的是，幾種化合物處理以后的類器官平均體積減少，表明這些化合物也抑制了類器官的生長。

分析完成后，將適當(dāng)讀數(shù)的數(shù)值數(shù)據(jù)導(dǎo)入曲線擬合軟件 (SoftMax Pro) ，確定毒性效應(yīng)的有效濃度。（也可以使用 Prism 或其他軟件進行 EC50 計算）。表 1 中列出了 EC50 值。主要結(jié)果可總結(jié)如下：除西沙必利外，所有測試的化合物均對腸道類器官產(chǎn)生了毒性效應(yīng)，這可以通過多種形態(tài)學(xué)變化得以測量。在觀察由肌動蛋白染色測量的細(xì)胞骨架完整性時，化合物的效應(yīng)最為顯著。隨著化合物濃度的增加，線粒體電位降低，但產(chǎn)生效應(yīng)的濃度通常高于細(xì)胞骨架完整性的濃度，這表明線粒體損傷并非細(xì)胞毒性的主要機制。相比之下，DNA 嵌合劑阿霉素、絲裂霉素、順鉑和阿糖胞苷降低了細(xì)胞核強度，這與這些化合物的預(yù)期作用機制一致。樣品經(jīng)大多數(shù)抗癌化合物，尤其是星形菌孢素、阿霉素、絲裂霉素、阿糖胞苷和曲美替尼處理以后，可觀察到類器官平均體積的減少，這與抑制細(xì)胞增殖一致，顯然限制了類器官的生長。

結(jié)果表明，處于活躍增殖狀態(tài)的健康腸道微組織對抗癌藥物引起的毒性效應(yīng)具有易感性，因此可以用于抗癌藥物副作用的體外評估。

高內(nèi)涵成像技術(shù)能夠測量并量化化合物的多種效應(yīng)，這些效應(yīng)反映了不同的表型變化，包括類器官的大小、標(biāo)記物的強度、完整或受損細(xì)胞的計數(shù)、細(xì)胞核強度或線粒體信號。該方法適用于體外評估藥物對健康腸道的毒性效應(yīng)。根據(jù)實驗設(shè)計，可以使用各種額外的標(biāo)記物來研究類器官中細(xì)胞亞型的其他特定效應(yīng)。這種方法不僅能夠評估細(xì)胞死亡表型，還能評估對線粒體、細(xì)胞核或細(xì)胞增殖的影響。通過增加分析讀數(shù)的數(shù)量并使用統(tǒng)計方法對化合物進行聚類分析，可以進一步增強多參數(shù)方法以及對不同讀數(shù)的同時分析，以發(fā)現(xiàn)相似的效果并進一步了解作用機制。

我們開發(fā)了一種使用高內(nèi)涵成像技術(shù)（HCS.ai 系統(tǒng)）和 IN Carta 圖像分析軟件，在 96 孔板中對腸道類器官進行化合物篩選的方法。該工作流程展示了在結(jié)合流程自動化和高內(nèi)涵成像的 protocol 中，如何利用復(fù)雜的類器官模型進行化合物測和毒性評估。這些方法能夠評估復(fù)雜類器官中的多種表型變化，適用于毒性評估研究。

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