本應用采用美正MUTIPURE多功能凈化儀結合高效液相色譜-紫外檢測器（HPLC-UV）建立了嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白的檢測方法。

樣品經磷酸鹽緩沖溶液提取，肝素親和柱富集凈化，C4色譜柱分離，外標法進行定量。結果表明，添加量為400 mg/kg時，乳鐵蛋白回收率在85% ~ 90%，能夠滿足檢測要求。

實驗部分

主要儀器設備

Aglient 1260高效液相色譜-紫外檢測器。

MUTIPURE多功能凈化儀。

試劑材料

0.1%三氟乙酸溶液：量取三氟乙酸1 mL，加水定容至1000 mL，混勻；

結合緩沖液：稱取30.083 g十二水合磷酸氫二鈉，2.496 g二水合磷酸二氫鈉，加900mL水溶解，加入20mL乳鐵蛋白提取試劑A（50倍濃縮液，肝素親和柱包裝盒中），ZH用水定容至1000 mL混勻；

洗脫液：稱取7.52 g磷酸氫二鈉，0.624 g磷酸二氫鈉，29.2 g氯化鈉，加400 mL水溶解，定容至500 mL混勻；

乳鐵蛋白標準儲備液（10 mg/mL）：準確稱取按其純度折算為100%質量的乳鐵蛋白各0.1 g于10 mL容量瓶中，加水溶解后定容至刻度；

肝素親和柱：3 mL（P/N：QC0140）。

樣品制備

1、樣品提取

精確稱量2.5 g樣品于離心管內，加入結合緩沖液30 mL，渦旋振蕩至樣本全部溶解，再加入結合緩沖液定容至50 mL，混勻，11000 r/min 4℃離心15 min，立即吸取25 mL中間層試液于另一50 mL離心管內，11000 r/min 4℃離心15 min，立即取出中間層至15 mL離心管，恢復至室溫后待凈化。

2、樣品凈化

將上述待凈化液按順序連接上樣管，再取15 mL離心管依次置于收集架上，將肝素親和柱連接在MUTIPURE多功能凈化儀上（如下圖），按照下表的指令設置方法，啟動儀器，由儀器自動完成凈化步驟。

肝素親和柱連接在MUTIPURE多功能凈化儀

MUTIPURE多功能凈化儀儀器參數

后處理:渦旋混勻，離心5 min，取上清液上機待測。

色譜條件

色譜柱：DAISOPAK SP-300-5-C4-BI0，4.6 × 250 mm；

流動相A ：0.1%三氟乙酸溶液；

流動相B : 乙腈；

柱 溫：30℃；

波 長：280 nm；

進樣量：30 μL；

流 速：1 mL/min；

梯度洗脫見下表。

液相色譜梯度洗脫條件

實驗結果

乳鐵蛋白加標回收實驗結果（添加水平400 mg/kg，n=4）

實驗譜圖

40 μg/mL乳鐵蛋白標準溶液色譜圖

嬰幼兒奶粉基質空白色譜圖

400 mg/kg嬰幼兒奶粉基質加標色譜圖

實驗結論

本實驗采用MUTIPURE多功能凈化儀結合高效液相色譜-紫外檢測器對于加標量為400 mg/kg的嬰幼兒奶粉進行檢測。

結果表明，使用MUTIPURE多功能凈化儀對嬰幼兒奶粉基質進行凈化，乳鐵蛋白回收率滿足要求且RSD小于10%，說明MUTIPURE多功能凈化儀適用于嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白的檢測，且方法穩定。

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