ibidi提供了一個簡單經(jīng)濟(jì)GX的方案，使用可移除的12孔腔室載玻片進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，固定和染色。培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞并用formalin溶液固定。細(xì)胞核用DAPI和肌動蛋白骨架用DYE-490鬼筆環(huán)肽染色。可以使用一抗和二抗染色通過免疫細(xì)胞化學(xué)探測其他細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。

德國ibidi 81201載玻片

實驗使用的材料和試劑列于下面。

• 12孔腔室載玻片，可移除（ibidi，81201）

• 用于腔室的蓋玻片，可移除，24mm x 60 mm（ibidi，10811）

• 細(xì)胞：MCF-7（CLS，300273）

• 細(xì)胞培養(yǎng)基

• 細(xì)胞培養(yǎng)試劑

• 聚苯硫醚

• formalin溶液中性緩沖液，10％（Sigma，HT5011）

• 染色試劑

o  DAPI（Sigma，D954）

o  DYE-490鬼筆環(huán)肽（Dynomics，490-33）

• 安裝介質(zhì)：FluoroshieldTm值（Sigma，F(xiàn)6182）

實驗方案：

步驟1：

必須在預(yù)實驗中確定細(xì)胞系的正確接種濃度。根據(jù)您的細(xì)胞類型，用2-6x10 4細(xì)胞/ ml在2-3天內(nèi)產(chǎn)生匯合的單層。
1.打開12孔可移除腔室載玻片（ibidi，81201）包裝，在無菌條件下可拆除。
2.像往常一樣用胰蛋白酶消化并計數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞濃度為5×104細(xì)胞/ ml MCF-7。
3. 將250μl細(xì)胞懸浮液加入腔室的每個孔中。避免搖晃，因為這會導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。
4. 用配套的蓋子蓋住。在37°C和5％CO2下培養(yǎng)。細(xì)胞至少培養(yǎng)24小時，或直到建立融合的單層

步驟2：

固定是染色程序的DY步。目標(biāo)是將細(xì)胞，細(xì)胞形成物或組織維持在其當(dāng)前狀態(tài)，并在較長時間內(nèi)通過化學(xué)試劑保存。
1.小心地吸出細(xì)胞培養(yǎng)基。
2.用PBS洗兩次。
3.加入250μl的formalin溶液。
4.在室溫下孵育30分鐘。
5.小心吸入formalin溶液。
6.用PBS洗滌三次。

步驟3：

應(yīng)根據(jù)感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核和肌動蛋白骨架。
1.準(zhǔn)備你的染色溶液：· 聚苯硫醚· DYE-490鬼筆環(huán)肽· DAPI 1μg/ml
2.小心吸出PBS。
3.移取250μl染色溶液到每個孔中
4.在室溫下避光孵育30分鐘

步驟4：

在染色后清洗你的樣本會使背景信號降到很低   
1.小心地吸出染色溶液 
2.加入250μl緩沖液     
3.小心吸入緩沖液   
4.重復(fù)步驟2和步驟3一次

步驟5：

從一個邊部開始，用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈。該步驟應(yīng)以緩慢，穩(wěn)定的進(jìn)行，以避免損壞細(xì)胞層。

步驟6：

完成染色程序后，必須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還防止樣品脫水。
1.將載玻片側(cè)面在干凈的實驗室濕巾上輕敲，從樣品中去除多余的介質(zhì)。
2.將封固劑涂在樣品上。用24毫米x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝的樣品，小心地將蓋玻片放到安裝介質(zhì)上，以避免夾住任何氣泡。推薦使用諸如FluoroshieldTm值（Sigma-Aldrich），Vectashield?（Vector Laboratories Inc.）或ProLongAntifade?（ThermoFisher Scientific）的硬化封固劑。
3.安裝封固劑固化。

步驟7：顯微觀察

使用12孔可移除載玻片培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，用DAPI和DYE 490鬼筆環(huán)肽染色細(xì)胞結(jié)構(gòu)。使用硬化封固劑安裝載玻片保存樣品以便長期儲存。
圖1用DYE490鬼筆環(huán)肽（左上）染色MCF-7細(xì)胞的肌動蛋白骨架，并用DAPI（右上）染色細(xì)胞核。下圖顯示了合成圖像，其中細(xì)胞核為藍(lán)色，肌動蛋白骨骼為綠色。（比例尺：100μm）

　　1. 基本信息

　　下面的應(yīng)用描述了小鼠巨噬細(xì)胞系RAW-264.7（生物安全等級2）在ibidi μ-Slides VI 0.4 和8孔腔室載玻片的培養(yǎng)方案。這是一個特殊的細(xì)胞系的例子，用于顯示粘附時間，細(xì)胞密度和細(xì)胞形態(tài)的示范。本應(yīng)用可根據(jù)您的具體實驗要求進(jìn)行調(diào)整。

　　2. 材料

　　在設(shè)置中應(yīng)用下列材料：

　　·RAW-264.7 (murine macrophages, CLS - Cell Lines Service, Biosafety Level 2) 

　　·Medium: RPMI 1640 with 2 mM L-Glutamin and 10% FBS 

　　·μ-Slide VI 0.4, ibiTreat （ibidi 80606）

　　·μ-Slide 8 well, ibiTreat （ibidi 80826）

　　·Accutase (PAA Laboratories GmbH) 

　　·1x Phosphate buffered saline (PBS) 

　　3. 細(xì)胞培養(yǎng)與材料制備

　　在將細(xì)胞接種到玻片中之前，按照常規(guī)的方法培養(yǎng)細(xì)胞。

　　μ-Slide VI 0.4 ：通道玻片和培養(yǎng)基，在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。這對于避免隨著時間的推移出現(xiàn)氣泡至關(guān)重要。為此，在50 ml器中填充適量的培養(yǎng)基，并輕輕地將瓶蓋擰緊。在 μ-Slide 8孔載玻片開放孔井中，氣泡可排出到大氣中。

　　拆開μ-Slide的包裝，把它放在μ-Slide支架上，并在準(zhǔn)備細(xì)胞懸浮液時同時將蓋子放在 Luer 適配器/孔上。

　　4. 播種細(xì)胞

　　分離細(xì)胞：

　　吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，并用PBS洗滌細(xì)胞一次。每75cm2 燒瓶中加入3-5 ml的Accutase，并將燒瓶放入培養(yǎng)箱中以加快分離速度。如果是RAW-264.7細(xì)胞系，則大約需要8分鐘。使用Accutase分離的細(xì)胞存活率更高。

　　4.1. 將細(xì)胞接種到μ-Slide VI 0.4中

　　在μ-Slide VI 0.4建議的細(xì)胞濃度：最終細(xì)胞數(shù)  0.3 x 10 5 cells/cm2，制備濃度6 x 10 5cells/ml。通過將移液器尖端直接放在通道的入口上，將30 μl細(xì)胞懸浮液填充到每個通道中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5％CO2下孵育半小時以固定細(xì)胞。

　　細(xì)胞貼壁后，分別用60 μl無細(xì)胞培養(yǎng)基填充儲液池。 避免將移液器吸頭直接指向通道的入口。將玻片放回培養(yǎng)箱中。

　　圖1：接種后一小時，在ibiTreat μ-Slide VI 0.4（貨號80606）中的RAW-264.7

　　圖2: 在ibiTreat μ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7，孵育24小時后

　　圖3:在ibiTreat μ-Slide VI0.4中的RAW-264.7，培養(yǎng)四天后

　　4.2 將細(xì)胞播種在μ-Slide 8 well 中

　　在μ-Slide 8 well建議的細(xì)胞濃度：最終細(xì)胞數(shù) 0.3 x 10 5 cells/cm2 ，制備濃度 1.1 x 10 5 cells/ml。將300 μl 的細(xì)胞懸浮液注入各孔中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5% CO2中孵育。不需要進(jìn)一步添加培養(yǎng)基。

　　圖4：在ibiTreat μ-Slide 8 well(貨號：80826)中的RAW-264.7，播種后1小時

　　圖5: 在ibiTreat μ-Slide 8 well中的RAW-264.7，孵育24小時后

　　圖6：在ibiTreat μ-Slide 8 well中的RAW-264.7，經(jīng)過四天的培養(yǎng)

　　為獲得最佳的分布的勻的細(xì)胞，我們建議使用像μ-Slide VI 0.4 這樣的通道載玻片。在8孔腔室載玻片中，細(xì)胞密度可能會在孔的整個表面上因點而異，具體取決于細(xì)胞播種過程中的處理。

　　5. 免疫熒光染色

　　像往常一樣為您的細(xì)胞固定和染色。

　　注意：在 μ-Slides 中染色時注意液體的處理

　　μ-Slide VI 0.4 ：更換液體，先吸出兩個儲液池而不排空通道。 如果您使用的是真空設(shè)備，請注意不要將吸頭直接放在通道的入口上。 用100 μl新溶液沖洗通道3次。 從一側(cè)添加新的溶液，通過通道流入另一個儲液池，然后從另一側(cè)吸出，直到兩個儲液池都排空。注意通道永遠(yuǎn)不要干涸！

　　μ-Slide 8孔載玻片：在 μ-Slide 8孔中，無需特殊處理措施。像在任何其他培養(yǎng)皿或孔板中一樣的交換液體。

　　下文中，給出了使用以下材料對細(xì)胞核和肌動蛋白絲進(jìn)行染色的示例：

　　細(xì)胞核：DAPI（Diamidino pheylindol dihydrochlorid） SIGMA, 32670 

　　肌動蛋白絲：Phalloidin, Alexa Fluor ? 488 Conjugate, LONZA, PA-3010 

　　1. 用3.7% 的PFA在PBS（pH 7.4）中室溫下固定細(xì)胞10分鐘。

　　2. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　3. 用Triton X 100（0.1%）孵育細(xì)胞5分鐘。

　　4. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　5. 用1%牛血清白蛋白在PBS中孵育20分鐘。

　　6. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　7. 在0.2μm濃度下用鬼筆環(huán)肽Alexa For 488孵育細(xì)胞20分鐘。

　　8. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　9. 用DAPI（0.5μg/ml）孵育細(xì)胞10分鐘。

　　10. 用PBS清洗細(xì)胞三次。

　　11. 完全吸出通道并用ibidi封片劑重新填充。 現(xiàn)在樣品可在顯微鏡上觀察了。保存在陰暗陰涼處可儲存數(shù)周。

　　圖7：在 μ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7用DAPI（細(xì)胞核、藍(lán)色）和Phalloidin, Alexa Fluor ? 488 Conjugate（肌動蛋白絲，綠色）

　　免疫熒光實驗原理

　　免疫熒光(IF)是使用顯微鏡深入了解細(xì)胞結(jié)構(gòu)和過程的有效方法。此方法可評估特定蛋白質(zhì)的表達(dá)和位置，使得免疫熒光成為科學(xué)家解決許多細(xì)胞生物學(xué)問題不可或缺的工具。

　　免疫熒光實驗基于以下主要步驟：

　　1.特異性抗體與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合。

　　2.熒光染料與這些免疫復(fù)合物偶聯(lián)，以便使用顯微鏡觀察感興趣的蛋白質(zhì)。

　　內(nèi)皮細(xì)胞中vWF的免疫熒光染色。肌動蛋白用phalloidin染色(綠色)，細(xì)胞核用DAPI染色(藍(lán)色)。

　　區(qū)分直接和間接免疫熒光。在直接免疫熒光中，一抗直接偶聯(lián)到熒光團(tuán)（也稱為熒光色素），便于處理和快速可視化。在間接免疫熒光中，使用特異性結(jié)合一抗的二級熒光團(tuán)偶聯(lián)抗體來可視化感興趣的結(jié)。

　　盡管di二種方法比直接免疫熒光更耗時，但它有幾個顯著的優(yōu)勢，比如它通常更便宜，因為二抗可以用于不同的一抗。此外，通過結(jié)合多個一抗和特定的二抗(每個抗體都用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記)，可以在單個樣品中平行特異地顯示多個蛋白質(zhì)(多色免疫熒光)。

　　免疫熒光染色:典型的工作流程

　　每個免疫熒光染色方案由培養(yǎng)、固定、染色、成像四個主要步驟組成，可細(xì)分如下:

　　免疫熒光染色是一種非常敏感的方法，可能需要排除故障《免疫英冠染色故障排除指南》。方案中的微小變化可能會導(dǎo)致不同的結(jié)果，而這些結(jié)果不再具有可比性。因此，在您的特定方案中精確地保持完全相同的條件是非常重要的(例如，細(xì)胞密度、抗體稀釋度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間)。

　　免疫熒光實驗方案對比

　　傳統(tǒng)染色與ibidi方案染色

　　當(dāng)使用任何ibidi解決方案時，ibidi的免疫熒光染色方案比傳統(tǒng)方案要簡便快速的多。無需在松散的蓋玻片上生長細(xì)胞，細(xì)胞可直接在ibidi玻片上生長和染色。

　　用于免疫熒光應(yīng)用的各種ibidi產(chǎn)品

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　　參考文獻(xiàn)

　　K.G. Zyner, A. Simeone, S.M. Flynn, et al. G-quadruplex DNA structures in human stem cells and differentiation. Nat Commun, 2022, 10.1038/s41467-021-27719-1

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　　Kobayashi, T., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature, 2017, 10.1038/nature22812

　　H. Tada et al. Porphyromonas gingivalis Gingipain-Dependently Enhances IL-33 Production in Human Gingival Epithelial Cells. PloS one, 2016, 10.1371/journal.pone.0152794

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