Hieff NGS^® DNA Library Prep Kit是針對(duì)Illumina^®和MGI^®高通量測(cè)序平臺(tái)專業(yè)開發(fā)設(shè)計(jì)的新一代建庫試劑盒。本產(chǎn)品采用高質(zhì)量的酶學(xué)組成，在前一代建庫試劑盒的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了DNA片段末端修復(fù)和加A效率，同時(shí)改善了接頭連接效率。本試劑盒采用新型的高保真酶，顯著提高擴(kuò)增均一性和保真性，可應(yīng)用于常規(guī)動(dòng)植物基因組、微生物基因組、FFPE、cfDNA、ChIP DNA等樣本，助力獲得優(yōu)異的測(cè)序數(shù)據(jù)。

• 適用100 pg-1000 ng所有DNA樣本，包含cfDNA、FFPE等
• 業(yè)界領(lǐng)先的文庫轉(zhuǎn)化率，最高可達(dá)70%以上
• 多樣本驗(yàn)證可獲得優(yōu)異的文庫與測(cè)序數(shù)據(jù)
• 嚴(yán)格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控

 

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)		組分名稱	13577ES08	13577ES24			13577ES96
13577-A		Endprep Buffer	56 μL		168 μL	672 μL
13577-B		Endprep Enzyme	24 μL		72 μL	288 μL
13577-C		Ligation Enhancer	240 μL		720 μL	3×960 μL
13577-D		Rapid T4 DNA Ligase	80 μL		240 μL	2×480 μL
13577-E		Canace® Pro Amplification Mix	200 μL		600 μL	3×800 μL

 

運(yùn)輸與保存方法

干冰運(yùn)輸。-25~-15 °C保存，有效期1年。

 

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時(shí)推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時(shí)請(qǐng)更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；使用專用的移液器等設(shè)備；并定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

二、關(guān)于DNA片段化

1. 本試劑盒中兼容機(jī)械法及酶切法片段化的DNA。

2. 本試劑盒兼容范圍為100 pg - 1000 ng Input DNA。應(yīng)盡可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。表1中列舉了將本試劑盒應(yīng)用于常見應(yīng)用中推薦的Input DNA量。

表1  常見應(yīng)用中推薦Input DNA量

應(yīng)用	樣本類型	推薦Input DNA量
全基因組測(cè)序	復(fù)雜基因組	50 ng-1000 ng
靶向捕獲測(cè)序	復(fù)雜基因組	10 ng-1000 ng
全基因組測(cè)序，靶向捕獲測(cè)序	FFPE DNA	50 ng-1000 ng
全基因組測(cè)序，靶向捕獲測(cè)序	cfDNA/ctDNA	≥500 pg
全基因組測(cè)序	微生物基因組	≥1 ng
全基因組測(cè)序PCR-free測(cè)序	高質(zhì)量DNA	≥50 ng

【注】：上表為使用高質(zhì)量DNA時(shí)推薦的Input DNA量，當(dāng)Input DNA質(zhì)量較差或需要進(jìn)行片段分選時(shí)，應(yīng)適當(dāng)上調(diào)使用量。

3. Input DNA特指投入末端修復(fù)/dA尾添加步驟中的DNA。

4. Input DNA制備過程中帶入的高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會(huì)影響末端修復(fù)/dA尾添加步驟反應(yīng)效率，建議DNA片段化后進(jìn)行磁珠純化或分選。當(dāng)使用機(jī)械法進(jìn)行DNA片段化且產(chǎn)物不進(jìn)行純化或長(zhǎng)度分選而直接建庫時(shí)，請(qǐng)將DNA稀釋在TE Buffer中進(jìn)行片段化，請(qǐng)勿在滅菌超純水中進(jìn)行。

三、關(guān)于接頭連接（Adapter Ligation)

1. 針對(duì)Illumina^®測(cè)序平臺(tái)，Yeasen提供Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 2 (Cat#13519~Cat#13520)，試劑盒中的接頭濃度為15 μM；Hieff NGS^® 384 CDI Primer for Illumina^®(Cat#12412~Cat#12413)，試劑盒中的接頭濃度為

15 μM；Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^® (Cat#12404~Cat#12407)，試劑盒中的接頭濃度為15 μM；Hieff NGS^® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina^®，Set1~Set2 （Cat#13370~Cat#13371），試劑盒中的接頭濃度為15 μM。

2.針對(duì)MGI^® 高通量測(cè)序平臺(tái)，Yeasen提供了Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 3（Cat#13360 ~ Cat#13362），試劑盒中的接頭濃度為10 μM；Hieff NGS^® 384 CDI Primer for MGI^®，Set 1~Set 2（Cat#13363 ~ Cat#13364），試劑盒中的接頭濃度為10 μM；也可搭配Hieff NGS^® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 2 (Cat#13367~Cat#13368)雙端UMI UDB短接頭，試劑盒中的接頭濃度為10 μM。

3. Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產(chǎn)量。Adapter用量過高可能會(huì)產(chǎn)生較多Adapter Dimer；用量較低可能會(huì)影響連接效率及文庫產(chǎn)量；使用Adapter時(shí)根據(jù)Input DNA量用TE Buffer進(jìn)行相應(yīng)稀釋。

表2列舉了使用本試劑盒的不同Input DNA量推薦的針對(duì)Illumina^®測(cè)序平臺(tái)的Adapter稀釋方法。

表3列舉了使用本試劑盒的不同Input DNA量推薦的針對(duì)MGI^®測(cè)序平臺(tái)的Adapter稀釋方法。

表4列舉了使用本公司Hieff NGS^® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina^®，Set1~Set2 （Cat#13370~Cat#13371）的不同Input DNA量推薦的UMI Adapter稀釋方法。

表5列舉了使用本公司Hieff NGS^® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 2 (Cat#13367~Cat#13368)的不同Input DNA量推薦的UMI Adapter稀釋方法。

表2  100 pg-1 μg Input DNA針對(duì)Illumina^®測(cè)序平臺(tái)推薦的Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter稀釋倍數(shù)	濃度
0.1ng ~ 1 ng	150倍稀釋	0.1 μM
1 ng ~ 10 ng	75倍稀釋	0.2 μM
10 ng ~ 25 ng	15倍稀釋	1 μM
25 ng ~ 100 ng	7.5倍稀釋	2 μM
100 ng ~ 1000 ng	3倍稀釋	5 μM

表3  100 pg-1ug Input DNA針對(duì)MGI^®測(cè)序平臺(tái)推薦的Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter稀釋倍數(shù)	濃度
0.1ng ~ 1 ng	100倍稀釋	0.1 μM
1 ng ~ 10 ng	50倍稀釋	0.2 μM
10 ng ~ 25 ng	10倍稀釋	1 μM
25 ng ~ 100 ng	5倍稀釋	2 μM
100 ng ~ 1000 ng	2倍稀釋	5 μM

表4  100 pg-1ug Input DNA針對(duì)Illumina^®測(cè)序平臺(tái)推薦的UMI Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter稀釋倍數(shù)	濃度
0.1ng ~ 1 ng	150倍稀釋	0.1 μM
1 ng ~ 10 ng	75倍稀釋	0.2 μM
10 ng ~ 25 ng	15倍稀釋	1 μM
25 ng ~ 100 ng	7.5倍稀釋	2 μM
100 ng ~ 1000 ng	3倍稀釋	5 μM

表5  5 ng-1ug Input DNA針對(duì)MGI^®測(cè)序平臺(tái)推薦的UMI Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter稀釋倍數(shù)	濃度
5 ng ~ 25 ng	50倍稀釋	0.2 μM
25 ng ~ 100 ng	10倍稀釋	1 μM
100 ng ~ 1000 ng	4倍稀釋	2.5 μM

四、關(guān)于磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. DNA片段長(zhǎng)度分選步驟可選擇在末端修復(fù)/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行。

2. 當(dāng)Input DNA質(zhì)量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質(zhì)量<50 ng，建議您在文庫擴(kuò)增后進(jìn)行分選。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會(huì)對(duì)雙輪磁珠分選產(chǎn)生顯著影響。因此，如在接頭連接后進(jìn)行長(zhǎng)度分選，必須先進(jìn)行純化步驟，再進(jìn)行雙輪分選步驟；如在末端修復(fù)/dA尾添加之前或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行長(zhǎng)度分選，可直接進(jìn)行雙輪磁珠分選步驟。

4. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

6. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

8. 進(jìn)行長(zhǎng)度分選時(shí)，初始樣品體積應(yīng)盡量≥100 μL，不足時(shí)請(qǐng)用超純水補(bǔ)齊。以防因樣品體積太小導(dǎo)致移液誤差增大。

9. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

10. DNA純化或長(zhǎng)度分選產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于4 °C可保存1-2周，-20 °C可保存1個(gè)月。

五、關(guān)于文庫擴(kuò)增 (Library Amplification)

1. 是否需要進(jìn)行文庫擴(kuò)增取決于Input DNA量、Adapter是否為完整長(zhǎng)度、應(yīng)用需要等因素。如使用非完整長(zhǎng)度Adapter，必須進(jìn)行這一步驟。如使用完整長(zhǎng)度Adapter，當(dāng)Input DNA<200 ng時(shí)，推薦進(jìn)行文庫擴(kuò)增；當(dāng)Input DNA≥200 ng或者不需要進(jìn)行文庫擴(kuò)增時(shí)，可不進(jìn)行文庫擴(kuò)增。

2. 文庫擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導(dǎo)致文庫產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多，又將導(dǎo)致文庫偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果。表6列舉了使用本試劑盒，獲得1 μg文庫的推薦循環(huán)數(shù)。

表6  100 pg-1000 ng Input DNA獲得1 μg產(chǎn)物擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表

Input DNA	1 μg文庫產(chǎn)量推薦PCR循環(huán)數(shù)
1000 ng	2 - 4
500 ng	2 - 4
250 ng	4 - 6
100 ng	5 - 7
50 ng	7 - 9
10 ng	9 - 11
5 ng	10 - 12
1 ng	12 - 15
100 pg	16 - 18

【注】：

1. 表6為使用200 bp左右的高質(zhì)量Input DNA測(cè)試的循環(huán)數(shù)參數(shù)。FFPE DNA質(zhì)量差異較大，當(dāng)DNA質(zhì)量較差或文庫長(zhǎng)度較長(zhǎng)時(shí)，需適當(dāng)提高循環(huán)數(shù)以獲取足量文庫。
2. 如果建庫過程中需要進(jìn)行過片段分選，推薦較高循環(huán)數(shù)進(jìn)行Library Amplification；反之則參照較低循環(huán)數(shù)即可。
3. 如果使用了不完整的接頭，需要擴(kuò)增至少2個(gè)循環(huán)，形成完整的接頭。

六、關(guān)于文庫質(zhì)檢 (Library Quality Analysis)

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2. 文庫濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對(duì)定量的方法。

3. 文庫濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫濃度檢測(cè)：Qubit^®、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí)，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對(duì)定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測(cè)序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫的干擾。

5. 文庫長(zhǎng)度分布檢測(cè)，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

 

自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。

3. DNA Adapter：可選Yeasen 官網(wǎng)的illumina平臺(tái)接頭Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 2 (Cat#13519~Cat#13520)；雙端384種CDI Primers：Hieff NGS^® 384 CDI Primer for Illumina^®, Set 1~Set 2 (Cat#12412~Cat#12413)；雙端384種UDI Primers：Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^® (Cat#12404~Cat#12407)，Hieff NGS^® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina^®，Set1~Set2 （Cat#13370~Cat#13371）DNA 文庫構(gòu)建專用配套試劑盒，或者可選匹配MGI平臺(tái)的接頭：Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 3（Cat#13360 ~ Cat#13362）；Hieff NGS^® 384 CDI Primer for MGI^®，Set 1~Set 2（Cat#13363 ~ Cat#13364）；Hieff NGS^® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 2 (Cat#13367~Cat#13368)；接頭詳細(xì)介紹信息參考上面注意事項(xiàng)中的第三部分“關(guān)于接頭連接”。

DNA Primer Mix：Cat#12190，DNA Library Prep Primer Mix for Illumina^® 或Cat#12191，DNA Library Prep Primer Mix for MGI^®。

4.其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer (10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁

力架、PCR儀等。

 

操作流程

圖1  Hieff NGS^® DNA Library Prep Kit操作流程