產(chǎn)品描述

Cyanine 3（Cy3），是花青素?zé)晒馑厝玖霞易宓某蓡T之一，是化學(xué)合成的聚甲炔染料。目前Cyanine系列染料以兩種異構(gòu)體的形式供貨，一種是非磺化花青素（non-sulfonated cyanines），一種是磺化花青素（sulfonated cyanine）。兩者的光譜性質(zhì)幾乎一致，因此大部分應(yīng)用可相互替換，比如，都可用于標(biāo)記DNA或蛋白等生物分子。兩者的主要區(qū)別在于：磺化染料是水溶性的，在水相的標(biāo)記反應(yīng)體系內(nèi)不需要使用有機(jī)共溶劑，并且降低染料在水中聚集的可能性，增強(qiáng)標(biāo)記效率。

本Cyanine 3（Cy3）是以磺化染料的形式供貨，易溶于水，Ex=555 nm，Em=565 nm，具有明亮熒光，光穩(wěn)定性強(qiáng)，pH非敏感性等優(yōu)點(diǎn)，適用于標(biāo)記多肽、蛋白以及核酸等生物分子，以通過后續(xù)熒光成像以及其他熒光生物學(xué)方法分析目的蛋白。

本Cy3 NHS ester，即含N-羥基琥珀酰亞胺（N-Hydroxysuccinimide）活化基團(tuán)的Cy3，可直接與生化分子上的氨基（-NH2）反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，主要是伯胺。

產(chǎn)品性質(zhì)

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20℃干燥避光保存，有效期1年。

注意事項(xiàng)

1）NHS ester基團(tuán)對濕度非常敏感，務(wù)必干燥保存產(chǎn)品。使用前產(chǎn)品需放到室溫回溫至少20min。

2）NHS ester基團(tuán)的水解發(fā)生在水溶性緩沖體系屬于競爭性反應(yīng)。對蛋白/多肽（濃度：1-1mg/ml）伯胺的連接反應(yīng)建議在pH 7-9范圍內(nèi)進(jìn)行。使用不含氨基的緩沖體系，pH 7-9。比如100 mM 磷酸鈉，150 mM 氯化鈉， pH 7.5； 100mM Hepes, pH 7.5。100 mM 碳酸鈉/碳酸氫鈉, pH 8-9；或100mM 硼酸緩沖液, pH 8-9。

3）不要使用含伯胺的任何緩沖液，比如Tris，甘氨酸。

4）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

5) 本產(chǎn)品僅作科研用途!

使用方法（用Cy3-NHS Ester 標(biāo)記抗體）

注意：可參考本方法進(jìn)行多肽，蛋白或者其他分子的標(biāo)記，需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)體系對合適的標(biāo)記緩沖體系，樣本濃度，染料濃度等參數(shù)做出合適的調(diào)整。

1）用不含氨基的合適的緩沖液（eg.100mM磷酸鈉，150mM NaCl, pH7.5）溶解抗體使其濃度達(dá)到1-5mg/mL。【注】：如抗體中有殘留Tris或 glycine 污染，則需透析或者脫鹽到合適的緩沖液內(nèi)。

2）使用前，用適量去離子水或者無水DMSO溶解Cy3-NHS，使其摩爾濃度為抗體摩爾濃度的400倍，例如，待標(biāo)記的IgG濃度為1mg/mL（eg 6.7µM），則溶解后Cy3-NHS的濃度為2.7mM；如待標(biāo)記的IgG濃度為2.5mg/mL，則溶解后Cy3-NHS的濃度為6.75mM；

3）向抗體中加入適量Cy3-NHS試劑，以達(dá)到預(yù)期的標(biāo)記效率。【注】：當(dāng)用Cy 3 NHS ester標(biāo)記抗體或其他蛋白，亮度最高的偶聯(lián)物其染料/蛋白的比率為4-12，取決于特定的應(yīng)用。過高比率會(huì)增加非特異性背景，喪失抗體特異性結(jié)合，導(dǎo)致聚集。建議根據(jù)應(yīng)用優(yōu)化標(biāo)記比率。

4）室溫孵育60min（或更長）；

5）利用合適緩沖液透析或脫鹽柱去除未反應(yīng)的試劑；

6）分別在280nm和550nm檢測Cy3-抗體的吸光值；

7）測定Cy3標(biāo)記效率（DOL）和標(biāo)記濃度。見下公式。

應(yīng)用舉例

用高于抗體摩爾濃度20倍的Cy3-NHS標(biāo)記 0.1 mL山羊IgG（濃度為1mg/mL）。標(biāo)記后脫鹽去除未標(biāo)記染料，在PBS中測定(1:5稀釋)測定其A280和A555:

A280=0.2906 

A555=0.9825

另：山羊IgG分子量為150kDa, E1%=13.6 or 204000M-1cm-1

計(jì)算DOL如下：

By Equation 2      Molarity of Cy3 dye=0.9825/150000 M-1cm-1=6.55µM

By Equation 3      Molarity of IgG =0.2906-(0.9825×0.08)/204000 M-1cm-1=1.039µM

By Equation 1      number of Cy3 per IgG=6.55µM/1.039µM=6.3

則計(jì)算Cy3-IgG protein 濃度為（mg/mL）：

By Equation 4     mg/ml=[0.2906-(0.9825×0.08)/1.36]×5=0.78mg/mL

 

HB180710