Hifair® Ⅲ One Step RT-qPCR SYBR Green Kit是以RNA為模板進行定量PCR反應的試劑盒。在實驗的過程中，逆轉錄和定量PCR在同一反應管中進行，簡化了實驗操作，降低了污染的風險。本試劑盒以RNA為模板，使用基因特異性引物，利用耐熱Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase高效合成第一鏈cDNA，并以此為模板在UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase作用下，配合優化的緩沖體系能夠特異靈敏的對RNA模板進行精確定量。同時Buffer中額外添加了有效抑制非特異性PCR擴增的組分和提高擴增能力的促進因子，使定量PCR結果可以在寬廣范圍內更加真實有效。

本試劑盒以Kit形式提供，2×Hifair® Ⅲ SG buffer包含優化的緩沖體系和dNTPs等，優化了有效抑制非特異性PCR擴增的因子和提升PCR反應擴增效率的因子，適用于SYBR Green標記的高特異性檢測系統。此外，Hifair® UH Ⅲ Enzymes包含比例優化的Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase、RNase inhibitor及UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase等。

產品信息

組分信息

*SG buffer為SYBR Green buffer的簡寫，UH為UNICON-Hifair的簡寫。

儲存條件

-25~-15℃避光儲存，有效期1年。本品避免反復凍融。建議分裝保存。

使用說明

表1反應體系(以20 μL為例)**

**使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。

a. 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μmol/L，也可以根據情況在0.1-1.0 μmol/L之間進行調整。

b. 參比染料：Rox的添加，可根據不同儀器型號進行選擇，具體可參考【適用機型】。

c. 模板稀釋：qPCR靈敏度極高，建議將模板進行稀釋使用，控制CT值在20-30之間適宜。

d. 反應體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。

e. 體系配制：請于超凈工作臺內配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。

表2 標準擴增程序***

***針對實驗需求可做適當調整。

a. 逆轉錄：對于一些極低豐度的基因可以將逆轉錄時間適當延長至15 min。

b. 溫度：對于含復雜二級結構或高GC含量的RNA模板，可將逆轉錄溫度提高到55℃，有助于提升靈敏度。

c. 熒光信號采集：不同的qPCR檢測儀器所需的熒光信號采集時間不同，請根據最短時間限制進行設置。

d. 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認程序。

適用機型

High Rox適用機型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus;

Low Rox適用機型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6, 7, 12k Flex;

     Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;

不需要Rox校正的儀器型號：

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler2.0, Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.

注意事項

1. 實驗過程中請使用RNase-free耗材。
2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
3. 本產品僅作科研用途！

Ver.CN20230404