產(chǎn)品簡(jiǎn)介

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔助因子。NADH是NAD+的還原形式，NAD+是NADH的氧化形式。NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。NADP用于合成代謝生物反應(yīng)，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作為還原劑。在葉綠體中，NADP是在光合作用的初步反應(yīng)中重要的氧化劑，光合作用產(chǎn)生的NADPH被用作光合作用卡爾文循環(huán)中生物合成反應(yīng)的還原力。傳統(tǒng)的NAD/NADH和NADP/ NADPH測(cè)定通過監(jiān)測(cè)340 nm處的NADH或NADPH吸收的變化來完成，但測(cè)定的短UV波長(zhǎng)使得這些方法具有低靈敏度和高干擾，且該分析是在紫外范圍內(nèi)進(jìn)行的，需要昂貴的石英微孔板。

翌圣生物提供的NADPH Fluorimetric Detection Assay Kit（Red Fluorescence）NADPH熒光檢測(cè)試劑盒（紅色熒光）為檢測(cè)NADPH提供了一種便捷的方法，系統(tǒng)中的酶會(huì)在酶循環(huán)反應(yīng)中特異性識(shí)別NADPH。此外，該測(cè)定具有非常低的背景，因?yàn)槠湓诩t色可見范圍內(nèi)運(yùn)行，這顯著降低了生物樣品的干擾。本試劑盒可以用于96或384微孔板分析，其信號(hào)可通過熒光酶標(biāo)儀（Ex/Em=540/590 nm）或吸光度酶標(biāo)儀（~576 nm）輕松讀取，建議使用純黑色的孔板。

組分信息

儲(chǔ)存條件

-25~-15℃避光保存，有效期12個(gè)月。

使用說明

1.溶液制備 

1.1準(zhǔn)備NADPH標(biāo)準(zhǔn)品的儲(chǔ)備溶液（1 mM）

將200 μL PBS緩沖液加入到NADPH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中以制備1 mM的NADPH儲(chǔ)備溶液。 【注意：未使用的NADPH儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-25~-15℃。】

1.2.準(zhǔn)備NADPH反應(yīng)混合物

將10 mL NADPH Assay Buffer（組分B）加入NADPH Recycling Enzyme Mix（組分A）的瓶中，并充分混合。【注意：配制的NADPH反應(yīng)混合物足以用于兩個(gè)96孔或四個(gè)384孔板。未使用的NADPH反應(yīng)混合物應(yīng)分成單次使用的等分試樣并避光儲(chǔ)存在-25~-15℃。】

1.3準(zhǔn)備NADPH標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋液（0.1372至100 μM）

將50 μL的NADPH儲(chǔ)備溶液（來自步驟1.1）加入到450 μL PBS緩沖液（pH=7.4）中以產(chǎn)生100 μM的NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液（NS7）。然后按照1：2比例依次稀釋以獲得其他濃度的NADPH標(biāo)準(zhǔn)品（NS6-NS1）。【注意：稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。濃度信息為：NS6：33.3333 μM；NS5：11.1111 μM；NS4：3.7037 μM；NS3：1.23460 μM；NS2：0.4115 μM；NS1：0.1372 μM】。

2.樣品分析

2.1根據(jù)表1和表2中提供的布局，將NADPH標(biāo)準(zhǔn)品和含有NADPH的測(cè)試樣品的系列稀釋液加入到固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中。

2.2將50 μL的NADPH反應(yīng)混合物（來自步驟1.2）加入NADPH標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照和測(cè)試樣品（來自步驟1.3）的每個(gè)孔中，使得總NADPH測(cè)定體積為100 μL/孔。注意：對(duì)于384孔板，每孔加入25 μL樣品和25 μL的NADPH反應(yīng)混合物，總體積為50 μL/孔。

2.3將反應(yīng)混合物在室溫下孵育15分鐘至2小時(shí)，避光。

2.4熒光酶標(biāo)儀下測(cè)量熒光數(shù)值，Ex/Em=540/590 nm。【注：也可測(cè)量Ex/Em=530-570/590-600 nm的熒光數(shù)值，但Ex/Em=540/590 nm處最佳。也可將板的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到白色透明底板上，用吸光度酶標(biāo)儀在576±5nm波長(zhǎng)下讀數(shù)。與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測(cè)具有較低的靈敏度。】

表1 實(shí)心黑色96孔微孔板中NADPH標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局[NS=NADPH標(biāo)準(zhǔn)品；BL=空白對(duì)照；TS=測(cè)試樣品]

注意：將連續(xù)稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)品（0.1372 μM至100 μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。

表2 每個(gè)孔的試劑組成

3.實(shí)驗(yàn)方案概述

3.1在開始實(shí)驗(yàn)之前，將所有試劑盒組件解凍至室溫。

3.2準(zhǔn)備NADPH反應(yīng)混合物（50 μL）。

3.3添加NADPH標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50 μL）。

3.4在室溫下孵育15分鐘到2小時(shí)，避光。

3.5監(jiān)測(cè)Ex/Em=540/590nm處的熒光強(qiáng)度。

4.數(shù)據(jù)分析

空白孔中的熒光（僅用PBS緩沖液）用作對(duì)照，從NADPH反應(yīng)的那些孔的值中減去該值，繪制NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。注意：作圖時(shí)每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)需減去空白孔的熒光強(qiáng)度值。

圖1 使用NOVOStar酶標(biāo)儀（BMG Labtech）在96孔黑色板中用NADPH熒光檢測(cè)試劑盒測(cè)量NADPH[在孵育1 h時(shí)，可以檢測(cè)到低至1 μM的NADPH，而NADP沒有響應(yīng)]

5.注意事項(xiàng)

1. 數(shù)據(jù)分析時(shí)注意空白孔中的熒光（僅用PBS緩沖液）用作對(duì)照，作圖時(shí)每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)需減去空白孔的熒光強(qiáng)度值。
2. 熒光染料均存在淬滅問題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
3. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
4. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

Ver.CN20240730