產品名稱

產品描述

 

本產品是2×實時定量PCR擴增的預混合溶液。具有高特異性和高檢出率的特點。采用的抗體法熱啟動Taq DNA聚合酶，在預變性溫度（95℃）加熱30 sec，急速釋放出Taq DNA Polymerase活性。UNICON® Taq抗體可以有效抑制樣品準備過程中引物退火導致的非特異性擴增。同時配方額外添加了有效抑制非特異性PCR擴增的組分和均衡不同GC含量（30%-70%）基因擴增的促進因子。使定量PCR結果可以在寬廣范圍內更加真實有效。

預混液含有所有PCR擴增的組分。使用時，僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進行實時熒光定量PCR，大大簡化操作過程，降低污染幾率。

運輸與保存方式
 

冰袋運輸。-20℃避光儲存，有效期18個月。

本品避免反復凍融。產品中含有熒光染料SYBR Green I，保存或配制反應體系時需避免強光照射。

注意事項
 

1. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（貨號：11123ES），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。

2. 產品解凍后如果發現不溶物，請上下顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
4. 本產品僅作科研用途！

反應體系（推薦冰上配制）
 

【注】：使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。
a) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1-1.0 μM之間進行調整。
b) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。
c) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環為好。
d) 反應體系：推薦使用20 μl或50 μl，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
e) 體系配制：請于超凈工作臺內配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。

【注】：高特異性可選擇兩步法，高效率擴增可選擇三步法。
a) 預變性時間：本反應條件適合大多數基因擴增，如果遇到含有復雜結構的基因可適當增加預變性時間至3-5 min。
b) 退火溫度和時間：請根據引物和目的基因的長度進行調整。
c) 熒光信號采集（★）：請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置，幾種常見儀器的時間設定如下:
30 sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96
31 sec以上：Applied Biosystems: 7300
34 sec以上：Applied Biosystems: 7500
d) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認程序。

結果分析
 

定量實驗至少需要三個生物學重復。反應結束后需要確認擴增曲線及熔解曲線。

1) 擴增曲線：標準擴增曲線為S型。

Ct值落在20-30之間時，定量分析最準確；

Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進行實驗；

Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度，或者增大反應體系的體積，以提高擴增效率，保證結果分析的準確性；

Ct值大于35時，檢測結果無法定量分析基因的表達量，但可用于定性分析。

2) 熔解曲線：

熔解曲線單峰，表明反應特異性好可以進行定量結果分析；若熔解曲線出現雙峰或者多峰，則不能進行定量分析。

熔解曲線出現雙峰，需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標峰是引物二聚體還是非特異性擴增。

如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設計擴增效率高的引物。

如果是非特異性擴增，請提高退火溫度，或者重新設計更高特異性的引物。

引物設計指南
 

1）推薦引物長度25 bp左右。擴增產物長度150 bp為佳，不要低于100 bp，可以在100 bp-300 bp內選擇。

2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。

3）引物堿基分布要均勻，避免出現連續的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。

4）引物內部或者正反兩條引物間最好避免出現有3個堿基以上的互補序列。

5）引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。

6）設計完成的引物需要進行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。

適用機型
 

Applied Biosystems: 7500, 7500 Fast, ViiA 7, QuantStudio Dx, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P.

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