產品簡介  

HisSep Ni-NTA Agarose Resin以交聯的6%瓊脂糖凝膠為基質，通過化學方法偶聯四配位的氮川三乙酸（NTA）為配體，螯合鎳離子（Ni²⁺）后，形成非常穩定的八面體結構，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結構可保護鎳離子免受小分子的進攻，更加穩定，可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等苛刻條件。已經成為實驗室純化His標簽蛋白不可或缺的樹脂之一。

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產品信息

貨號	20502ES10 / 20502ES50 / 20502ES60 / 20502ES80
規格	10 mL / 50 mL / 100 mL / 2x500 mL

 

產品性質

基質（Matrix）	交聯的6%瓊脂糖凝膠
粒徑（Bead size）	45-165 µm
載量（Capacity）	＞40 mg 6×His-tagged protein/mL 基質
耐壓（Tolerance Pressuremax）	0.1 MPa, 1 bar
儲存緩沖液（Buffer）	含20%乙醇的1×PBS

 

儲存條件

2~8℃保存，有效期2年。

 

使用說明

1. 純化流程

1. 緩沖液的準備

緩沖液使用原理：低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高pH上樣，低pH洗脫。Buffer 在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm濾膜過濾除菌。HisSep Ni-NTA Agarose Resin可以用于可溶性蛋白和包涵體蛋白的純化，可溶性組氨酸標簽蛋白純化所需配方詳見附表1。包涵體組氨酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方詳見附表2。

2. 樣品準備

1. 細菌表達的蛋白（本說明以細菌表達蛋白為例）

a）挑取單菌落到含有適合抗性的LB培養基中，根據載體說明加入相應的誘導劑誘導相應的時間。

b）表達結束后，將培養液轉至離心瓶，7000 rpm，離心15 min，收集菌體，然后加入1/10體積的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其終濃度為1 mM），同時也可加入其他蛋白酶抑制劑（如蛋白酶抑制劑Cocktail（用于His-Tag蛋白純化）, EDTA-free, 100×DMSO儲液，Cat#20135ES03），但不能影響目的蛋白與樹脂的結合。

c）之后加入溶菌酶，使其工作濃度為1 mg/mL。【注】如果表達的宿主細胞內含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。

d）將菌體沉淀懸浮起來（如果菌液濃度高，可考慮加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I），混勻，置于冰上超聲破碎細胞，至菌液基本保持澄清。

e）收集上述澄清蛋白液，10000 rpm，4℃離心20-30 min。取上清，0.22 µm/0.45 µm濾膜過濾后，置于冰上備用或-20℃保存。

2. 酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達的可溶性蛋白

將細胞培養液轉移至離心瓶，5000 rpm離心10 min，收集上清。如上清中不含EDTA、組氨酸和還原劑等，即可直接上柱純化；如含有EDTA、組氨酸和還原劑等物質，則需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。

【注】對于大量體積的上清，需加入硫酸銨進行沉淀濃縮，之后經1×PBS 4℃下透析后上柱。

3. 包涵體蛋白純化（以細菌為例，變性條件）

a）將培養液轉移至離心瓶，7000 rpm，離心15min，收集菌體去上清。

b）按照菌體：裂解液（不含8 M尿素）=1:10（w/v）的比例將菌體充分懸浮，混勻，冰浴超聲破碎。

c）將破碎液轉移至離心管，10000 rpm，4℃離心20-30min，去上清。可重復步驟b）和c）一次。

d）按照菌體：裂解液（含8 M尿素）=1:10（w/v）的比例將包涵體充分懸浮。

e）變性條件下純化His標簽蛋白。

3. HisSep Ni-NTA Agarose Resin重力柱的裝填

1. 取合適規格的重力層析柱（Cat#20520ES-20524ES），裝入下墊片，加入適量純水潤洗柱管和墊片，關閉下出口。
2. 將HisSep Ni-NTA Agarose Resin混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入重力柱中（填料實際體積占懸液的一半），打開下出口流干保護液。
3. 加入適量純水沖洗填料，待柱管中液體重力流干后，關閉下出口。
4. 加入潤洗后的上墊片，確保墊片與填料之間沒有空隙，且保持水平。
5. 裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進行平衡，暫不使用時則加入保護液，4℃保存。

4. 樣品純化

1.   孵育法純化

1. 根據純化的樣品量，取適量HisSep Ni-NTA Agarose Resin加入離心管中，1000 rpm離心1 min, 吸棄上清；也可加入重力柱中，流干保護液。
2. 向離心管中加入5倍介質體積的Lysis Buffer清洗填料，1000 rpm離心1 min，吸棄上清；如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗，直接重力流干Lysis Buffer；重復兩次以上。
3. 加入樣品，封閉離心管或重力柱管，4℃振蕩孵育2~4 h或者37℃孵育30 min~2 h。
4. 孵育結束后，1000 rpm離心1 min，吸棄上清，或過濾收集填料，上清保留作為流穿，用于電泳鑒定。
5. 用5倍填料體積的 Wash Buffer清洗填料，1000 rpm離心1min 或重力柱管過濾，去除上清（注意不要吸到填料），重復3-5次，中間建議更換新離心管。必要時可以調整咪唑的濃度進行洗雜。
6. 加入3-5倍柱體積的Elution Buffer進行洗脫，室溫孵育10-15 min，1000 rpm離心1 min或重力柱管收集洗脫液，可重復2-3次。

2.   重力柱法純化

a）將裝填好HisSep Ni-NTA Agarose Resin 的重力柱用5倍柱體積Lysis Buffer進行平衡，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下，重復2-3次。

b）將樣品加到平衡好的重力柱中，樣品保留時間至少2 min，保證樣品和填料充分接觸，收集流出液，可以反復上樣增加結合效率。

c）用10-15倍柱體積的Wash Buffer進行洗雜，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。必要時可以調整咪唑的濃度進行洗雜。

d）用5-10倍柱體積的Elution Buffer洗脫，分段收集，每一個柱體積收集一管，分別檢測，既可以保證所有結合的目的蛋白被洗脫，又可以得到高純度和高濃度的蛋白。

e）隨后依次用3倍柱體積的Lysis Buffer和5倍柱體積的去離子水清洗填料。5倍柱體積的20%乙醇平衡填料，最后將填料保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

5. SDS-PAGE檢測

將純化過程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進行檢測，判定其純化效果。

2. 在位清洗                                                                                                當填料使用過程中發現反壓過高（＞0.5 MPa）或者填料上面出現明顯的污染時，需對其進行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1. 去除強疏水結合的蛋白，脂蛋白和脂類

使用30%異丙醇清洗5-10個柱體積，接觸時間為15-20 min可以去除此類污染物。之后再用去離子水清洗10倍柱體積。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或者堿性溶液，清洗填料2倍柱體積。例如含有0.1-0.5%非離子去污劑的0.1 M醋酸溶液，接觸時間為1-2 h。去污劑處理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱體積，徹底去除去污劑。最后使用去離子水清洗10倍柱體積。

2) 去除離子作用結合的蛋白

使用1.5 M NaCl 溶液接觸10-15 min，之后用去離子水清洗10倍柱體積。

3. 填料再生

His標簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經常螯合去除和重新掛鎳離子。當填料使用過程中發現反壓過高（＞0.5 MPa），顏色變淺，或填料載量明顯變低時，需要對其進行鎳離子剝離及重新掛鎳處理，即填料再生。按照下面操作流程進行：

a）使用5倍柱體積去離子水清洗填料；

b）使用5倍柱體積100 mM EDTA（pH 8.0）剝落鎳離子；

c）使用10倍柱體積去離子水清洗填料；

d）使用0.5 M NaOH清洗5倍柱體積，停留10-15 min；

e）使用去離子水清洗填料，直至pH中性；

f）使用3-5倍柱體積100 mM NiSO₄再生掛鎳；

g）使用10倍柱體積去離子水清洗。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃備用。

 

注意事項

1. 本產品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

 

附表1 可溶性His標簽蛋白純化所需緩沖液及配方

緩沖液名稱	配方	配制1L溶液所需各種試劑量
Lysis Buffer (pH8.0)	50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 10 mM imidazole NaOH調pH至8.0, 0.22 µm或0.45 µm過濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8 g NaCl             17.54 g Imidazole         0.68 g
Wash Buffer (pH8.0)	50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 20 mM imidazole NaOH調pH至8.0, 0.22 µm或0.45 µm過濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8 g  NaCl             17.54 g Imidazole         1.36 g
Elution Buffer (pH8.0)	50 mM NaH2PO4  300 mM NaCl 250 mM imidazole NaOH調pH至8.0, 0.22 µm或0.45 µm過濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8 g NaCl             17.54 g Imidazole         17.0 g

 

附表2 包涵體His標簽蛋白純化所需緩沖液及配方

緩沖液名稱	配方	配制1L溶液所需各種試劑量
Lysis Buffer (pH8.0)	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調pH至8.0, 0.22 µm或0.45 µm過濾除菌	Urea             480.5 g NaH2PO4 ·2H2O   15.6 g Tris·HCl          15.76 g
Wash Buffer (pH6.3)	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調pH至6.3, 0.22 µm或0.45 µm過濾除菌	Urea             480.5 g NaH2PO4 ·2H2O   15.6 g Tris·HCl          15.76 g
Elution Buffer (pH4.5)	8 M Urea 100 mM NaH2PO4  100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調pH至4.5, 0.22 µm或0.45 µm過濾除菌	Urea             480.5 g NaH2PO4 ·2H2O   15.6 g Tris·HCl          15.76 g

附表3 HisSep Ni-NTA Agarose Resin 試劑耐受情況

試劑種類	濃度
還原劑	5 mM DTE 0.5-1 mM DTT 20 mM β-mercaptoethanol 5 mM TCEP 10 mM reduced glutathione
變性劑	8 M urea 6 M Gua-HCl
去污劑	2% TritonTM X-100(nonionic) 2% TweenTM20(nonionic) 2% NP-40(nonionic) 2% Cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic)
其他類	500 mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mM Na2SO4 1.5 M NaCl 1 mM EDTA 60 mM citrate
緩沖液	50 mM sodium phosphate, pH7.4 100 mM Tris-HCl, pH7.4 100 mM Tris-acetate, pH7.4 100 mM HEPES, pH7.4 100 mM MOPS, pH7.4 100 mM sodium acetate, pH7.4

附表4 問題及解決方案