Hieff NGS^® Ultima DNA Library Prep Kit for Illumina^®是針對Illumina^®高通量測序平臺(tái)定向優(yōu)化而成的新一代建庫試劑盒。作為全新的升級(jí)版本，本產(chǎn)品采用高質(zhì)量的酶學(xué)組成，簡化的操作流程，可顯著提高低質(zhì)量樣本文庫轉(zhuǎn)化率與擴(kuò)增效率，具有廣泛的樣本適應(yīng)性，同時(shí)兼容FFPE、cfDNA、ChIP DNA等樣本，助力獲得優(yōu)異的測序數(shù)據(jù)。

• 適用500 pg-1 μg DNA樣本
• 兼容cfDNA、FFPE等低質(zhì)量樣本
• 高效的文庫轉(zhuǎn)化率與擴(kuò)增效率
• 多樣本驗(yàn)證可獲得優(yōu)異的文庫與測序數(shù)據(jù)
• 嚴(yán)格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控

產(chǎn)品組分

組分編號(hào)與名稱		12199ES96
12199-A	Endprep Mix	960 μL
12199-B	Ligation Enhancer	4×720 μL
12199-C	Fast T4 DNA Ligase	480 μL
12199-D	2×Ultima Amplification Mix	4×600 μL
12199-E	Primer Mix	480 μL

 

運(yùn)輸與保存方法

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途！為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時(shí)推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時(shí)請更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；使用專用的移液器等設(shè)備；并定時(shí)對各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

二、關(guān)于DNA片段化

1. 本試劑盒中兼容機(jī)械法及酶切法片段化的DNA。

2. 本試劑盒兼容范圍為500 pg – 1 μg Input DNA。應(yīng)盡可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。表1中列舉了將本試劑盒應(yīng)用于常見應(yīng)用中推薦的Input DNA量。

表1  常見應(yīng)用中推薦Input DNA量

應(yīng)用	樣本類型	推薦Input DNA量
全基因組測序	復(fù)雜基因組	50 ng-1 μg
靶向捕獲測序	復(fù)雜基因組	10 ng-1 μg
全基因組測序，靶向捕獲測序	FFPE DNA	≥50 ng
全基因組測序，靶向捕獲測序	cfDNA/ctDNA	≥500 pg
全基因組測序	微生物基因組	≥1 ng
全基因組測序PCR-free測序	高質(zhì)量DNA	≥100 ng
免疫共沉淀測序	ChIP-DNA	≥500 pg
靶向測序	擴(kuò)增子	≥500 pg

【注】：上表為使用高質(zhì)量DNA時(shí)推薦的Input DNA量，當(dāng)Input DNA質(zhì)量較差或需要進(jìn)行片段分選時(shí)，應(yīng)適當(dāng)上調(diào)使用量。

3. Input DNA特指投入末端修復(fù)/dA尾添加步驟中的DNA。

4. Input DNA制備過程中帶入的高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會(huì)影響末端修復(fù)/dA尾添加步驟反應(yīng)效率，建議DNA片段化后進(jìn)行磁珠純化或分選。當(dāng)使用機(jī)械法進(jìn)行DNA片段化且產(chǎn)物不進(jìn)行純化或長度分選而直接建庫時(shí)，請將DNA稀釋在TE Buffer中進(jìn)行片段化，請勿在滅菌超純水中進(jìn)行。當(dāng)使用酶切法進(jìn)行片段化且產(chǎn)物不進(jìn)行純化或長度分選而直接建庫時(shí)，請確認(rèn)Stop Buffer中不包含過量的金屬離子螯合劑。如條件不滿足，可先將片段化產(chǎn)物純化或長度分選后溶于TE buffer或滅菌超純水中(≤50 μL)，再進(jìn)行文庫構(gòu)建。

三、關(guān)于接頭連接(Adapter Ligation)

1.本公司可提供長接頭(Indexed Adapter)試劑盒和短接頭（也稱為小Y接頭、不完整接頭）試劑盒，客戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。

目前有48種Complete Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)；

單端 96種Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^®, Set 1~Set 2 (Cat#12611~Cat#12612)；

雙端384種Index Primers: Hieff NGS^® 384 CDI Primer for Illumina^®, Set 1~Set 2 (Cat#12412~Cat#12413)。

2. Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產(chǎn)量。Adapter用量過高可能會(huì)產(chǎn)生較多Adapter Dimer；用量較低可能會(huì)影響連接效率及文庫產(chǎn)量。表2列舉了使用本試劑盒，不同Input DNA量推薦的Adapter使用量。

表2  500 pg-1 μg Input DNA推薦的Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter : Input DNA摩爾比	Input DNA	Adapter : Input DNA摩爾比
1 μg	10:1	50 ng	100:1
500 ng	20:1	25 ng	200:1
250 ng	40:1	1 ng	200:1
100 ng	100:1	500 pg	400:1

【注】：Input DNA摩爾數(shù)(pmol)≈ Input DNA質(zhì)量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度(bp)]。

四、關(guān)于磁珠純化與分選(Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. DNA片段長度分選步驟可選擇在末端修復(fù)/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行。

2. 當(dāng)Input DNA質(zhì)量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質(zhì)量<50 ng，建議您在文庫擴(kuò)增后進(jìn)行分選。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會(huì)對雙輪磁珠分選產(chǎn)生顯著影響。因此，如在接頭連接后進(jìn)行長度分選，必須先進(jìn)行純化步驟，再進(jìn)行雙輪分選步驟；如在末端修復(fù)/dA尾添加之前或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行長度分選，可直接進(jìn)行雙輪磁珠分選步驟。

4. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

6. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

8. 進(jìn)行長度分選時(shí)，初始樣品體積應(yīng)盡量≥100 μL，不足時(shí)請用超純水補(bǔ)齊。以防因樣品體積太小導(dǎo)致移液誤差增大。

9. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

10. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于4 °C可保存1-2周，-20 °C可保存1個(gè)月。

五、關(guān)于文庫擴(kuò)增(Library Amplification)

1. 是否需要進(jìn)行文庫擴(kuò)增取決于Input DNA量、Adapter是否為完整長度、應(yīng)用需要等因素。如使用非完整長度Adapter，必須進(jìn)行這一步驟。如使用完整長度Adapter，當(dāng)Input DNA<200 ng時(shí)，推薦進(jìn)行文庫擴(kuò)增；當(dāng)Input DNA≥200 ng或者不需要進(jìn)行文庫擴(kuò)增時(shí)，可不進(jìn)行文庫擴(kuò)增。

2. 文庫擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導(dǎo)致文庫產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多，又將導(dǎo)致文庫偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果。表3列舉了本試劑盒，獲得100 ng或1000 ng文庫的所需循環(huán)數(shù)。

表3  500 pg-1 μg Input DNA獲得100 ng或1000 ng產(chǎn)物擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表

Input DNA	Number of cycles required to generate
	100 ng	1000 ng
1 μg	-	2 - 4*
500 ng	-	3 - 5
250 ng	1 - 3*	4 - 7
100 ng	2 - 4*	5 - 8
50 ng	4 - 6	7 - 10
10 ng	6 - 8	8 - 12
5 ng	7 - 9	10 - 14
1 ng	9 - 11	12 - 15
500 pg	11 - 13	13 - 16

【注】：*如果使用了不完整的接頭，需要擴(kuò)增1-3個(gè)循環(huán)，形成完整的接頭。建庫過程中進(jìn)行過長度分選時(shí)參照較高循環(huán)數(shù)擴(kuò)增。

六、關(guān)于文庫質(zhì)檢(Library Quality Analysis)

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫濃度檢測：Qubit^®、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時(shí)，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測。

 

使用方法

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。

3. DNA Adapter：可選Yeasen Complete Adapter: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1-4 (Cat#12615-12618);

單端 96種 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1-2 (Cat#12611~Cat#12612)；

雙端 384 種 Index Primers: Hieff NGS^® 384 Dual Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1-2 (Cat#12613~Cat#12614)。

或其他等效產(chǎn)品。

4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5), 0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。

二、操作流程

 

圖1  Ultima DNA建庫試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1 末端修復(fù)/dA尾添加(End Repair/dA-Taling)

該步驟將Input DNA末端補(bǔ)平，并進(jìn)行5’端磷酸化和3’端加dA尾。

1. 將表4中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表4所示反應(yīng)體系。

表4  末端修復(fù)/dA尾添加PCR反應(yīng)體系

名稱	體積 (μL)
Fragmented DNA	x
Endprep Mix	10
ddH2O	Up to 60

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表5所示反應(yīng)程序，進(jìn)行末端修復(fù)/dA尾添加反應(yīng)。

表5  末端修復(fù)/dA尾添加PCR反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間
熱蓋105 °C	On
30 °C	20 min
72 °C	20 min
4 °C	Hold

3.2 接頭連接(Adapter Ligation)

該步驟將3.1步驟的產(chǎn)物末端，連接特定的Illumina^®接頭。

1. 根據(jù)Input DNA量按表2稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表6中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.1步驟PCR管中配制表6所示反應(yīng)體系。

表6  Adapter Ligation PCR體系

名稱	體積 (μL)
dA-tailed DNA（3.1步驟產(chǎn)物）	60
Ligation Enhancer	30*
Fast T4 DNA Ligase	5
DNA Adapter	5**

【注】：*Ligation Enhancer比較粘稠，請上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時(shí)后離心使用。

**本公司接頭濃度與常規(guī)商業(yè)化試劑盒一致，皆為15 μM。

【接頭添加計(jì)算舉例】：當(dāng)Input DNA為100 ng，Input DNA長度為300 bp時(shí)，接頭應(yīng)該添加多少？

第一步，計(jì)算Input DNA摩爾數(shù)。公式：Input DNA摩爾數(shù)(pmol)≈ Input DNA質(zhì)量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度(bp)]；

Input DNA 摩爾數(shù)(pmol)=100÷(0.66×300)=0.5 pmol；

第二步，計(jì)算接頭添加摩爾數(shù)。根據(jù)注意事項(xiàng)三表2查詢接頭添加比例；

根據(jù)表2，查得Input DNA 100ng時(shí)接頭添加比例100:1，則接頭添加摩爾數(shù)=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步，計(jì)算接頭添加體積。接頭濃度=15 μmol/L（如使用其他接頭，濃度需要依據(jù)其他接頭濃度參數(shù)）；

接頭添加體積=接頭添加摩爾數(shù)(50 pmol)÷接頭濃度(15 μmol/L)=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL)

綜上，接頭可添加3.4 μL，加1.6 μL水補(bǔ)齊至5 μL。（注：接頭最大加入體積不超過5 μL）。

4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表7所示反應(yīng)程序，進(jìn)行接頭連接反應(yīng)：

表7  Adapter Ligation PCR反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間
熱蓋105 °C	Off
20 °C	15 min
4 °C	Hold

【注】：當(dāng)Input DNA量較低，實(shí)驗(yàn)效果不理想時(shí)，可嘗試將連接時(shí)間延長一倍。

3.3 連接產(chǎn)物磁珠純化(Post-Ligation Clean Up)

該步驟使用磁珠對3.2步驟的產(chǎn)物進(jìn)行純化或分選。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無效產(chǎn)物。

3.3.1 純化操作步驟

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，進(jìn)行洗脫：

1) 如產(chǎn)物無需進(jìn)行片段分選，直接加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。【注：如純化產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

2) 如產(chǎn)物需進(jìn)行雙輪分選，加入102 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。【注：如純化產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

3.3.2 雙輪分選操作步驟

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡約30 min。配制80%乙醇。

2. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

3. 根據(jù)DNA片段長度要求，參考表8向上述100 μL DNA上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻。

表8  磁珠文庫分選推薦比例

DNA文庫插入片段大小	150 - 250 bp	200-300 bp	300-400 bp	400-500 bp	500-600 bp
DNA文庫大小	250 - 350 bp	350-450 bp	450-550 bp	550-650 bp	650-750 bp
第一輪體積比(Beads:DNA)	0.80×	0.70×	0.60×	0.55×	0.50×
第二輪體積比(Beads:DNA)	0.20×	0.20×	0.20×	0.15×	0.15×

【注】：表中“×”表示樣品DNA體積。如文庫插入片段長度為250 bp，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.70×100 μL=70 μL；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL；表中所推薦比例是針對于Adapter Ligated Insert DNA (Post Ligation)，如果用戶在接頭連接前進(jìn)行分選，請采用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Cat#12601)說明書中推薦的比例。

4. 室溫孵育5 min。

5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中。

6. 參考表8向上清中加入第二輪分選磁珠。

7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重復(fù)步驟9。

11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中。

3.4 文庫擴(kuò)增(Library Amplification)

該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集。

1. 將表9中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表9所示反應(yīng)體系。

表9  PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

名稱	體積 (μL)
2×Ultima Amplification Mix	25
Primer Mix	5
Adapter Ligated DNA（3.3步驟產(chǎn)物）	20

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表10所示反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表10  PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

溫度	時(shí)間	循環(huán)數(shù)
98 °C	1 min	1
98 °C	10 sec	參照注意事項(xiàng)中表3
60 °C	30 sec
72 °C	30 sec
72 °C	5 min	1
4 °C	Hold	-

3.5 擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠純化或分選 (Post-Amplification Clean Up/Size Selection)

同3.3.1步驟中純化操作步驟。使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)純化文庫擴(kuò)增產(chǎn)物。

如需分選，操作方法同3.3.2雙輪分選步驟（純化步驟可省略）。

 

3.6 文庫質(zhì)量控制

通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，具體請參見注意事項(xiàng)六。

3.7 參考實(shí)例

使用Hieff NGS^® Ultima DNA Library Prep Kit for Illumina^®對100 ng FFPE樣本建庫（未分選），結(jié)果使用Agilent 2100 DNA 1000 Chip進(jìn)行檢測。

圖2  Ultima DNA建庫試劑盒用于FFPE樣本建庫（未分選）