產品描述

淋巴細胞分離液（Lymphocyte Separation Medium 1.084，簡稱LSM-1.084）是一種無菌的即用型分離液，基于Böyum的Ficoll-甲泛影鈉溶液做過一些改良，使得操作簡單快速且分離效率更高。本品是無菌的聚蔗糖Ficoll/泛影酸鈉混合溶液，密度為1.084 g/ml，內毒素含量很低（＜0.12 EU/mL），是在嚴格控制的環境下加工生產的，生產條件符合ISO13485:2003標準和GMP認證。相對于密度為1.077 g/mL的人淋巴細胞分離液，本品適用于分離更高密度的人單個核細胞，包括外周血，臍帶血以及骨髓瘤來源的組織樣本。還適用于分離大小鼠血細胞，正因為嚙齒動物的淋巴細胞密度稍高于人淋巴細胞。

 

工作原理

去纖維蛋白或抗凝人血以1：1的比例用無菌生理鹽水或平衡鹽溶液稀釋，小心的添加在分離液上層（不要混雜在一起），之后離心30-40 min。離心過程中，差速遷移使其最終形成幾個不同的細胞分層：

① 聚集在管底的顆粒主要是Ficoll 聚集的紅細胞以及沉淀物；

② 緊挨著上面一層的顆粒主要是粒細胞，其處于LSM-1.084溶液的滲透壓臨界，具有足夠高的密度遷移穿過LSM-1.084溶液層。

③ 單個核細胞分布在血漿和LSM-1.084分離液的中間層，還包括一些沉降系數低（密度低）的顆粒，如血小板。

淋巴細胞，單核細胞和血小板不具有足夠高的密度穿透LSM-1.084分離液層，因此這些細胞在血漿和LSM-1.084分離液層聚集形成一個中間分層。吸取中間層，用平衡鹽溶液短暫洗滌，以除去血小板，細胞分離介質和血漿，就可以分離單個核細胞。通常情況下，分離所得的細胞中95±5%為單個核細胞，細胞存活率＞90%，回收率為60±20%。

 

運輸與保存方法

室溫運輸。4-30 °C密閉避光環境下可穩定保存3年，開瓶后需4-8 °C保存。

 

影響單個核細胞分離效果的因素

1. 血液樣品保存時間

血液盡可能新鮮且無血塊，為獲得最佳分離效果，最好在取血2h內進行實驗。血液放置過久可能會降低細胞存活率、回收率，甚至有可能引入粒細胞和紅細胞污染，放置超過6h可能會嚴重影響分離效果。

2. 血液體積

血液量和管徑決定樣本在管子中的高度，以及后續的離心時間。提高離心管內的血液高度會引入紅細胞污染的可能。但是分離效率不會明顯受管徑的影響。因此，對于體積大的血樣，建議可在保持離心時間不變的情況下選擇更大直徑的離心管。

3. 紅細胞去除

單個核細胞分離的產量和純度與紅細胞是否去除干凈有關。

若全血中紅細胞發生凝集會導致一些單個核細胞也被聚集在內，從而在離心后被沉降在紅細胞層內。可通過稀釋全血的方法來避免此現象。溫度大小會影響紅細胞的凝集，18℃條件能提供最佳的分離效果。若溫度升高（如37℃）會提高紅細胞凝集的可能，降低分離效果。低溫（4℃）環境紅細胞聚集可能降低，需要增加離心時間。提高離心時間到5-10 min能減低紅細胞污染。

4. 血小板污染

對于血小板要求較為嚴格的分離實驗，使用4-20%的蔗糖梯度層加在LSM-1.084溶液層上方，再次離心以去除所有的血小板。離心后，血小板分布在蔗糖溶液上方，單個核細胞穿過蔗糖溶液停留在LSM-1.084溶液上方。

 

操作方法

1. 材料準備

1）樣本體積（4 mL總體積）：取2 mL的去纖維蛋白或抗凝血，將其與等體積（2 mL）的無菌鹽溶液以1：1比例混合。注：大體積的血樣可以得到相同的分離效率，只需要選用更大直徑的離心管，以維持血樣的高度（約3 cm）和LSM-1.084溶液的高度（約2.4 cm）。

2）LSM-1.084分離液，使用前需放到室溫環境下溫度平衡10-30 min；

3）平衡鹽溶液：用做稀釋和清洗液，建議直接購買商業化的鹽溶液。也可以使用其他溶液，如不含Ca²⁺/Mg²⁺的磷酸鹽溶液（如DPBS溶液），Hank’s，或者細胞培養液（如RPMI 1640）。

2. 分離單個核細胞

1）取2 mL的去纖維蛋白或抗凝血，將其與等體積（2 mL）的無菌鹽溶液以1：1比例混合，于10-15 mL離心管中顛倒混勻，或用槍上下輕輕吹打數次以至混勻。

注：肝素、EDTA、檸檬酸鈉、ACD、CPD抗凝皆可。去纖維蛋白血不需要抗凝劑。

2）使用前輕輕顛倒瓶子使LSM-1.084充分混合，用注射器或槍頭無菌條件轉移3 mL LSM到10-15 mL離心管中。

3）小心將稀釋血液加入3 mL LSM-1.084（室溫即可）的上層，使得在血液和LSM間形成一個明顯的分層。不要將稀釋血液混入LSM-1.084中，如圖1。

 

圖1. 加樣后分層示意圖

4）室溫下400×g離心30-40 min，離心可以沉淀紅細胞和多形核白細胞，同時可以在LSM-1.084上形成一層單核-淋巴細胞分層，如圖2所示（從上到下，依次分為血漿層-單個核細胞層-LSM-1.084層-粒細胞-紅細胞）。

5）用無菌槍頭吸掉單個核細胞層（含淋巴細胞和單核細胞）上方2-3 mm的血小板/血漿，小心操作勿吸入單個核細胞層內破壞其平衡（如圖2）。

注：也可以不用先吸走血漿層，直接用槍吸取單個核細胞層。另外，上層血漿不含細胞，也可以留作他用。
 

                     

圖2.吸除上層血漿和血小板前后分層示意圖

 

6）用無菌槍頭將單核細胞層轉移入一個新的無菌離心管。

注：一定要吸取所有的單個核細胞中間層，以及少量上方的血漿液和下方的LSM-1.084分離液。

7）預估轉移后的單個核細胞量，加入至少3倍體積（約6 mL）的平衡鹽溶液于上述離心管中。

8）使用槍頭上下輕輕吹打將單層細胞溶液充分懸浮。

9）室溫400-500×g離心10-15 min。

注：高速離心有助于提高單個核細胞的回收率，但如果需要徹底去除血小板，則推薦低速離心（60-100×g）。

10）去除上清，加入6-8 mL平衡鹽溶液重懸單核細胞。

11）室溫400-500×g（或者60-100×g去除血小板）離心10 min。

12）去除上清，用適當培養基重懸單個核細胞備用。

3. 分離粒細胞

1）-6）同上方單個核細胞的分離步驟。

7）小心吸除LSM-1.084層，注意切勿吸入粒細胞層。

8）轉移暴露在表面的白色粒細胞層（位于紅細胞層上方）于一個無菌的50mL離心管。

9）加入至少5倍體積的平衡鹽溶液重懸粒細胞，于400×g離心15 min。

10）吸除上清，加入6-8 mL平衡鹽緩溶液重懸粒細胞，于室溫400-500×g離心10 min。

11）吸除上清，用適當培養液重懸粒細胞備用。

 

注意事項

1）稀釋去纖維蛋白血液或肝素化血液用的鹽溶液為無菌液體。

2）為保持淋巴細胞的活性，應該采血后盡快進行分離。分離細胞層實際上是單個核細胞層，包括淋巴細胞和單核細胞。

3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作；

4）本產品僅作科研用途！

 

HB211105